晶体结构的解析
方法：分子置换（MR）法 模型：PaPDF-Actinonin
PDB号：1IX1
软件：CNS, O, CCP4
模型分子结构示意图
PDF的晶体结构
PDF及其复合物的晶体结构
A:PDF+8+9 B:PDF+8 C:PDF+9
BB83698
LBM415
进入I期临床的PDF抑制剂
PDF的二级结构中含有37.8% α-螺旋、 26.6% β-折叠、16.3%β-转角和19.3% 无规卷曲
PDF酶活性的测定
N-formyl-Met-Ala-Ser + H2O NAD formate
PDF NADH
formate + Met-Ala-Ser
aromatic amino acids
莽草酸途径
饱和脂肪酸合成途径
SDH 性质研究
SDH的二级结构中含有29.2% α-螺 旋, 9.3% β-折叠, 32.7% β-转角, 28.8%无规卷曲
SDH质谱鉴定
30038.0
SDH酶活性测定
SDH species HpSDH
kcat (s-1)
抑制细菌细胞壁的合成 影响胞浆膜通透性 抑制细菌蛋白质的合成 抑制核酸代谢 抗叶酸代谢
——影响细胞膜通透性——
多粘菌素类
→ 与G-菌胞浆膜磷脂结合
多烯类抗真菌药 → 与真菌胞浆膜麦角固醇结合 咪唑类抗真菌药 → 抑制真菌胞浆膜固醇合成
——抑制细菌蛋白质合成——
细菌核蛋白体为70S，30S+50S 哺乳动物核蛋白体为80S，40S+60S 四环素类 → 通过与 30S 核糖体亚基结合 氯霉素类 林可霉素类 通过与 50S 核糖体亚基结合 大环内酯类 氨基苷类 → 影响蛋白质合成全过程
二. 机体、药物和病原体三者之间的相 互关系
三. 常见的抗菌药物
30年代——磺胺类 40年代——青霉素 50年代——红霉素、四环素、氯 霉素 60年代——广谱半合成青霉素类 一代头孢 氨基糖苷类 70年代——广谱半合成青霉素类 二代头孢 80年代——三代头孢 氟喹诺酮类（第三代 喹诺酮类）
四. 抗菌药物的作用机制
细胞中无此靶点
• 在致病微生物的生理代谢中起到至关重
要的作用
• 易于在体外（in vitro）和体内(in vivo)进行检测来自七. 抗菌药物的新靶点
• 细胞壁合成途径(Mur)
• 莽草酸途径(Aro) • 饱和脂肪酸合成途径(Fab)
细胞壁合成途径
Phosphoenolpyruvate + erythrose 4-phosphate DAHP synthase 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate 3-dehydroquinate synthase 3-dehydroquinate 3-dehydroquinate dehydratase 3-dehydroshikimate Shikimate 5-dehydrogenase Shikimate Shikimate kinase Shikimate 3-phosphate EPSP synthase 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate Chorismate synthase Folic acid Chorismate Ubiquinone
αKi (μM)
44.5±4.2 8.1±0.9 28.3±2.6 58.9±3.7
化合物1， MIC= 16 μg/ml 化合物2， MIC= 16 μg/ml 化合物5， MIC= 32 μg/ml
PDF的研究
蛋白质的合成示意图 (a) 细菌细胞 (b) 哺乳动物细胞
PDF抑制剂
PDF抑制剂主要有：异羟肟酸类（Actinonin、VRC3375、VRC-4307）、N-甲酰羟胺类（LBM415、 BB3497、BB83868）、巯基肽类等。
—— 抑制核酸合成 ——
喹诺酮类
抑制DNA回旋酶→ 复制受阻 → DNA合成↓
利福平
抑制依赖DNA的RNA多聚酶→转录受阻 →mRNA↓
五. 细菌的耐药机制
耐 药 性：病原体对反复应用的化学治疗 药物敏感性降低或消失的现象。 耐药性的分类：固有耐药性和获得耐药性 耐药机制:降低胞浆膜通透性 产生灭活酶（水解酶，钝化酶） 水解酶，钝化酶 改变药物靶位结构 药物主动外排系统功能增强 改变代谢途径
Km (mM) (shikimate) 0.148
Km (mM) (NADP) 0.182
kcat/Km (M-1s-1) (shikimate) 5.2×104
kcat/Km (M-1s1) (NADP) 4.23×104
7.7
温度和pH值对SDH酶活性的影响
最适反应温度 60 °C，最适pH值 8-9
PDF及其抑制剂复合物晶体的生长
70％MPD, pH7.5 Hepes Additive: 20% Dioxane 浸泡摩尔浓度比： 9: HpPDF=20:1 8:HpPDF=8:1
晶体衍射的数据收集
X射线光源： Rigaku rotating-anode X射线电源： 50 kV, 100 mA X射线波长： 1.5418Å（Cu Kα） 探测器： Rigaku R-AXIS IV++ IP 曝光时间： 5 min 晶体到探头的距离： 150 mm Δφ：1˚ 画面收集数：90
晶体衍射数据的处理
apo HpPDF Space group Cell parameters (Å) (a, b, c) Resolution range (Å) No. of observed reflections (I/σ> 0) No. of unique reflections Redundancy I/σ Completeness (%) Rmerge (%) P212121 42.25, 53.05, 91.16 12.0-2.2 (2.28-2.20) 41172 10685 3.8 (3.7) 6.6 (2.2) 98.7 (96) 9.8 (28.7) complex with 8 P212121 42.12, 52.97, 92.26 12.0-2.2 (2.28-2.20) 35722 10663 3.3 (3.2) 8.1 (3.3) 97.7 (96.6) 7.5 (19) complex with 9 P212121 42.17, 52.94, 91.79 12.0-2.2 (2.28-2.20) 33614 10780 3.1 (3.0) 6.0 (2.4) 99.4 (99.3) 9.7 (24.5)
应对策略：
• 筛选具有新作用靶位的新型抗菌药 • 修饰现有抗生素与抗菌药的化学结构 • 寻找提高机体防御功能的物质 • 控制与清除耐药性基因
Genomics-driven, targets-directed drug design and discovery
六. 靶点选择的标准
• 只存在于致病微生物中，而在哺乳动物
H2CO3 FDH
PDF species
Kcat (s-1) 3.4±0.6
Km (mM) 1.7±0.4
Kcat/Km (M-1s1) 2000
Co-HpPDF
PDF抑制剂发现
化合物8、9对PDF有较强的抑制作用
化合物 8 (○)，化合物 9 (■) 化合物 8 IC50= 10.8 μM 化合物 9 IC50= 1.25 μM
The development of drug target for antimicrobial agents 韩 聪
一.常用名词解释
抗生素（antibiotics)：是指由放线菌或霉菌在其代 谢过程中产生的对其它病原体有杀灭或抑制作用的 物质。 抗菌药物（antibacterial agents)：是指对机体内致 病的细菌和真菌有杀灭或抑制作用的药物。包括抗 生素和人工合成的化学药物 抗微生物药物（antimicrobial agents)：是用于治疗 病原微生物感染性疾病的药物，能抑制或杀灭病原 微生物，包括抗细菌药、抗真菌药和抗病毒药。
化学治疗（chemotherapy)：是指对机体内病原体，包括 病毒、微生物、寄生虫、恶性肿瘤细胞，采用化学药 物的治疗。 化学治疗药物（chemotherapeutic agents)：是指对机体 内病原体（病原微生物、寄生虫、恶性肿瘤细胞）有 杀灭或抑制作用的药物。包括抗微生物药、抗寄生虫 药和抗肿瘤药。
SDH抑制剂发现
化合物1-5 对SDH有较强的抑制作用
化合物1-5的抑制类型
(A) 化合物 1 (B) 化合物 2 (C) 化合物 3 (D) 化合物 4 (E) 化合物 5
化合物1-5的抑制作用
Compound 1 2 3 4 5 Inhibition mode noncompetitive noncompetitive noncompetitive competitive noncompetitive IC50 (μM) 15.4±2.2 3.9±0.5 13.4±3.1 2.9±0.2 3.5±0.7 Ki (μM) 5.9±0.7 3.9±0.4 18.2±4.3 1.8±0.3 15.4±1.1