优点：固定相不易流失 适用于各种样品的分离分析
分类
正相键合相色谱法： 极性键合相，如氨基柱、氰基柱 适用：极性化合物 反相键合相色谱法： 非极性键合相，如C18柱、C8柱 适用：非极性至中等极性化合物
1、反相键合相色谱法（RP-HPLC）
1）分离原理
流动相与溶质有排斥力，促使溶质分子与键 合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可 逆的。
中碳型：R1、R2其中一个是氢，一个为 氯 低碳型： R1、R2都是氯
表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目， 占硅胶表面硅醇基总数的比例。
作用：决定了键合相是分配还是吸附占 主导
封尾：为了减少残余的硅醇基，一般在 键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子 进行钝化处理。
反相键合相色谱法（RP-HPLC）
3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 > 固定相极性
问：①哪个先出柱
②若要增大tR，应增大甲醇还是水的比例?
2、正相键合相色谱法（NP-HPLC）
1）分离机制： 2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3）流动相：极性小
底剂 + 有机极性调节剂 ✓ 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇
正相键合相色谱法（NP-HPLC） 4）流动相极性与k的关系：
流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓
5）出柱顺序：极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱
6）适用： 氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似 氨基键合相：糖类等
3．离子对色谱法（IPC或PIC）
反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离
Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5m ）色谱柱 (Aschaffenburg, Germany)。流动相： (A)乙腈-(B)0.3%醋酸水溶液进行梯度洗脱： 0-30min：A 28%，B 72%； 30-53min： A 28％升至34％，B 72％降至66％； 53-70min： A 34％升至80％，B 66％降至20％。 流速：1.0 ml·min-1；
第3节 各类高效液相色谱法
吸附色谱法 化学键合相 离子对色谱法
一、吸 附 色 谱 法 1．分离原理 2．固定相：极性和非极性固定相 3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂
二、 化学键合相色谱法
（bonded phase chromatography, BPC）
化学键合相：采用化学反应的方法 将固 定液的官能团键合在载体表面上。
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（
dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装 柱
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温25-300C左右。太低，流动相黏度增加，
太高容易产生气泡
二、柱 外 展 宽
从进样器到检测器之间的体积称柱外死 体积，均可导致色谱展宽，柱效下降。 减免方法：应尽可能减少柱外死体积
第12章 高效液相色谱 法
high performance liquid chromatography HPLC
HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
固定相颗粒较大，不均 匀 常压下输送流动相 柱效低 分析周期长
现代液相色谱
固定相颗粒小，均匀
高压下输送流动相 柱效高 分析周期短
第2节 基本理论-速率理论
2. 纵 向 扩 散 项 B/u
样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起 峰展宽
B=2γDm Dm ∝T/η
液相色谱中Dm比GC中小105
u是最佳流速的3-5倍
B/u忽略
3.流动的流动相传质阻力项Cmu
流动相本身，处于不 同层流的分子具有不 同流速。
Cm

d
2 p
/
Dm
Dm ∝T/η
减免方法：1）减少固定相颗粒直径 2）减少流动相液体黏度（甲醇）
1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季胺盐→分析酸
2）影响k的因素 a．与m的极性有关（同反相色谱） b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑ 3）适用：较强的有机酸、碱
3．洗脱方式
1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱
2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）
4. 静态流动相传质阻力项Csmu
原因：处于固定相颗粒 内部孔洞内静态流动相 引起
影响Csmu的因素与Cm相同
5. 固定相的传质阻力项Csu
影响因素：固定相内部阻力影响
Cm

d
2 f
/
Ds
减免方法：减少固定相液膜厚度 ——化学键合相
6、HPLC法中分离条件的选择
H = A + （Cm+Csm）u
底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，四氢呋喃
反相键合相色谱法（RP-HPLC）
4）流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑
5）出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱
6）适用：非极性-中等极性组分
例： 用ODS柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇水（95：5）
一、柱内展宽
H A B / u (Cm Csm Cs )u
Csm为静态流动相传质阻力系数
1. 涡 流 扩散 项 A
组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱峰 展宽。
影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度
减少方法 ： a 降低dp：目前商品柱多采用3-5μm粒径 b 降低λ：采用球形、均匀分布固定相。
检测波长：230℃；
DAD1 E, Sig=275,16 Ref =of f (F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG035.D) mAU
20
Luna
0
0
10
k↓，组分tR↓
反相键合相色谱法（RP-HPLC）
2）固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱）
十八烷基键合相：常用的非极性键合相
R1
Si
OH + Cl Si
C18H37
R2
R1
Si O Si
R2
C18H37 + HCl
键合相分类
高碳型：R1、R2是两个甲基 特点：载样量大，保留能力强