人染色体观察
一、 实验原理
染色体是细胞遗传物的研究对象，分析染色体行为对于认识遗传物质的传递、复制、畸变等都有得要的意义。

所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养基中进行培养。

人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。

向培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。

二、实验用品
1、材料：人血
2、试剂：RPMI1640（TC199或F10均可）培养液、小牛血清、肝素、PHA、10μg/ml秋水仙素、5%NaHCO
3、0.075mol/L KCl、青、链霉素、1NHCl、姬姆萨染液、pH6.8磷酸盐缓冲液、冰醋酸、甲醇。

3、仪器设备：超净工作、显微镜、恒温水浴箱、冰载玻片、酒精灯等。

三、实验步骤
1、培养液的配制和分装：在超净工作上，用吸管吸取RPMI1640液40ml、小牛血清10ml，用1ml注射器取肝素0.3ml、PHA0.5~1.0ml、青、链霉素0.3ml （各10000单位/ml）混合均匀后，用NaHCO3或1N HCl调整pH为7.2~7.4，分装于培养瓶中，每瓶ml，用胶布封口。

2、培养：用小瓶接种全血0.3~0.5ml左右，摇匀。

在37℃培养箱中培养68~72小时，培养终止前6~7小时加10μg/ml秋水仙素2-3滴。

3、收集细胞：自培养箱取出培养瓶，用吸管将培养物混匀，并移至10ml 刻度离心管内，以1000rpm离心6-8分钟。

4、低渗处理：吸去上清液，加入预热至37℃的O.4%KCl液7-8ml，用吸管吸打沉淀，使之混匀，放入37℃水浴箱中，静置20-30分钟。

5、预固定：加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）1ml，吸打均匀，
立即以1000rpm离心6-8分钟。

6、固定：除去上清液，加入5-6ml固定液，打匀细胞团块，室温下静置20分钟，以1000rpm离心6-8分钟，除去上清液，重复6步1-2次。

7、滴片：视细胞数量的多少，加入0.5~1ml左右的固定液，将沉淀吸打成细胞悬液，用吸管吸取细胞悬液2-3滴，滴于冰水浸泡过的冷、湿的载玻片上，在酒精灯上略加烘烤，使其干燥，（或用电吹风机吹干载玻片）。

8、染色：将载玻片放在染色架上，滴加姬姆萨染液染色10-20分钟。

自来水冲洗，干后镜检。

四、实验结果
取上述制备好的正常人体细胞染色体玻片标本，先在低倍镜下观察，选择染色体分散良好，无重叠的分裂中期细胞（此时已看不到细胞膜与核膜）。

然后转至油镜下仔细观察分析。

首先数该细胞染色体总数，再注意观察染色体的形态，每条染色体含有两条染色单体，两染色单体连接处为着丝粒，注意每条染色体的大小和着丝粒的位置。

区分中央着丝粒染色体、亚中央着丝粒染色体和端着丝粒染色体。

五、注意事项
1、PHA的用量要适中，否则会出现溶血或凝血现象。

2、秋水仙素的处理时间要适当，否则会使染色体不易观察。

3、滴片时，吸管与载玻片距离高一点，这样分裂相分散良好，尽量避免染
色体重迭。

六、思考题
在外周血培养及染色体制片过程中加入PHA、秋水仙素及0.4%KCl溶液的作用是什么？。