具体步骤：
1. 细胞用预冷的PBS液洗涤 2 次，最后洗涤完成后吸干PBS液。

2. 加入预冷的RIPA Buffer（ 1ml/107 个细胞、 6cm 培养皿、 75cm2 培养瓶）。

3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入管中，EP 管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min 。

4.4℃， 14000g 离心 15min 。

5.立即将上清液转移到一个新的离心管中。

6. 准备 Protein A 琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。

*为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。

7. 每 ml 总蛋白中加入100ul Protein A 琼脂糖珠（ 50%）， EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃 10min 。

*目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。

8.4℃， 14000g 离心 15min ，将上清转移到一个新的离心管中。

9.测定蛋白浓度，可选用 Bradford 法做蛋白标准曲线。

10.蛋白定量，分装， -20℃保存，可保存 1 个月。

11.用 PBS液将总蛋白稀释至约 1ug/ml 。

12.加入 500ul 稀释好的兔抗到总蛋白中。

13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。

14. 加入 100ul Protein A 琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。

15.14000rpm 瞬时离心 5s，去上清，收集琼脂糖珠 -抗原抗体的复合物。

16.用 800ul 预冷 RIPA buffer 冲洗 3 遍。

17.用 60ul 2 倍上样缓冲液将琼脂糖珠 -抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。

18.将上样样品煮 5min 。

19.14000g 离心，收集剩余琼脂糖珠。

20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min 变性。

21.上清也可以暂时冻 -20℃，留待以后电泳。

基础成分
（1） Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分）
（2） NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分）
（3） NP-40（用 H2O 配置成 10%储存液。

NP-40 为非离子去污剂，用于提取蛋白）
（4）去氧胆酸钠（用 H2O 配置成 10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存）
*因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去
氧胆酸钠。