血吸虫抱雌沟蛋白与幼虫巨大致死基因作用
? 构建p3 和质粒 ? 两质粒共转染 293T 细胞 ? 分离免疫沉淀复合物 ? 用抗体共沉淀 蛋白，用抗体验证。
家蚕微孢子虫胞壁蛋白单克隆抗体 靶蛋白的分离与质谱鉴定分析
? 利用微孢子虫胞壁蛋白制备2株单抗，鉴定分别 G10 识别虫体蛋白的三种成分， B10识别55左右一 种成分。
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免疫沉淀原理图解
2 免疫共沉淀定义
免疫共沉淀（，）是以抗体和抗原之间 的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互 作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整 细胞内生理性相互作用的有效方法。
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免疫共沉淀原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整 细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互 作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免 疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能 沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋 白质是否在体内结合；也可用于确定一种特 定蛋白质的新的作用搭档。
3 与质谱分析
原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用 抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共 沉淀纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳 分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。
3 与质谱分析流程
4: 应 用
34重组质粒的构建及其在 7 细胞中的表达与定位
? 4为人P21活化激酶4，构建其34真核质 粒
? 转染7细胞。 ? 裂解细胞后用抗体免疫沉淀细胞裂解液
? 裂解虫体提取总蛋白利用制备的单抗进行免疫共 沉淀
? 切取结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱 （）分析，得到相应的肽序列标签
? 鉴定得出结论G10识别的70左右条带为热休克蛋白 70，B10识别的是一种未曾报到的蛋白，分析得到 其相关信息
THE END
Thank you
1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－ 蛋白质相互作用
2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而 可能有第三者在中间起桥梁作用；
3. 如用 检验，必须在实验前预测目的蛋白 是什么，以选择最后检测的抗体，若预测 不正确，实验就得不到结果，实验本身具 有冒险性。
实验的关键
1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和 抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在反应。 建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性 是问题。
2 免疫共沉淀原理图解
IP CO-IP
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CA
C A+B
D
蛋白A ， 蛋白B 抗A抗体C进行洗脱 抗B抗体D进行验证
优点
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态；
2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响；
3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复 合物。
缺点
实验室讨论
免疫共沉淀技术
1: 2: 3: 与质谱分析 4: 用
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免疫沉淀定义
免疫沉淀（ ）是利用抗体特异性反应 纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗体 可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常 为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。
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免疫沉淀步骤
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的 蛋白结合后，再与蛋白（），通过离心得到 珠子- 蛋白或二抗- 抗体- 目的蛋白复合物， 沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液， 煮沸5-10，在高温及还原剂的作用下，抗原 与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗 体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
2. 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必 须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。
3. 考虑抗体 /缓冲液的比例。抗体过少就不能检出 抗原，过多则就不能沉降在上，残存在上清。缓冲 剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
3与质谱分析 质谱分析
质谱法( , ) ，即用电场和磁场将 运动的离子（带电荷的原子、分子或分 子碎片）按它们的质荷比分离后进行检 测的方法。测出了离子的准确质量，就 可以确定离子的化合物组成。
，沉降4蛋白。 ? 鉴定被沉降的目的的蛋白表达。
研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白
? P53 基因为一种人体抑癌基因人体癌症发生约 一半由于该的基因突变失活。
? 抗p53 抗体与1和2总蛋白进行免疫共沉淀 ? 分离免疫沉淀复合物 ? 切取p53 结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串
联质谱（）分析，得到相应的肽序列标签 ? 搜索数据库 分析目的蛋白相关数据