直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法：
+ B-E + A ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
直接法
间接法
（3）标记生物素-抗生物素法 标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin， LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合， 由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对 免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB 法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍， 与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较 低
4.1.5 在ELISA中的应用 用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗 体，然后连接亲和素-酶结合物(BA-ELISA)、或亲 和素及酶标生物素(BAB-ELISA)或ABC试剂(ABCELISA)，从而使反应信号放大，提高检测的灵敏 度。王传彬等用生物素标记的纯化抗禽流感病毒 H5亚型血凝素单抗和酶标亲和素检测H1、H15亚 型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离株， 与血凝和血凝抑制试验比较，纯化后的单抗具有 良好的反应活性。祝军等将BA-辣根过氧化物酶 复合物系统ELISA策略，对ANEPⅢ寡核苷酸适配 子的亲合力进行测定。
4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡
2.上样
3.洗杂 具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。 2.生物素易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，再和生物素 衍生物结合，将信号多级放大，能保持大分子物质的原有生 物活性。 3.亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度 专一性，不增加非特异性干扰，也不会因反应试剂浓度高低 受影响。 4.酸、碱、变性剂及有机溶剂均不会影响亲和素与生物素的结 合力。裴仁军等试验结果表明，链霉亲和素与生物素能够在 结合表面形成均一的多层膜维系紧密的结合。 5.BAS不仅能与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合， 还可制成亲和介质，用于分离提纯。 6.BAS操作方便，反应结果可用肉眼观察，实验成本低。
酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤（间接法）
1 包被抗原 2 洗涤 3 待测血清（抗体） 4 洗涤 5 酶标二抗 6 洗涤 7 显示物A、B 8 加终止液 (H2SO4)
酶标板
桥-亲和素-生物素标记（BAB法）步骤
间接法步骤：
1包被抗原 2洗涤 3待测抗体 4洗涤 5生物素标二抗 6洗涤 7加亲和素 8洗涤 9加酶标生物素 10洗涤 11加底物 12显色后加终止液
四 应用
1
在免疫学中的应用
免疫荧光技术中的应用 免疫放射技术中的应用 胶体金技术中的应用 免疫酶技术中的应用 ELISA中的应用
2
3
4
在分子生物学中的应用 在组织化学中的应用 在分离纯化中的应用（亲和层析）
4.1 在免疫学中的应用
4.1.1 在免疫荧光技术中的应用 BAS应用于免疫荧光分析(fluorescence immunoassay，FIA)技术， 可用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素)或采用游离亲和素(或链霉亲和素)搭桥， 两端分别连接生物素和荧光素。与常规荧光抗体法或单独的BAS标记法相比， BAS标记法结合荧光抗体技术可明显地提高检测的灵敏度和特异性。 张锦明等用99Tcm替代111In标记BAS在肿瘤放免显像预定位DTPA-生物素溶液， 结果测得99Tcm-DTPA-生物素的标记率大于90%。 4.1.2 在免疫放射技术中的应用 BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶联， 先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与 抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物， 再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合， 最终使反应信号放大。 李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗， 最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定， 结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星， 与传统放射性同位素杂交法相结合，构建筛选大黄鱼的微卫星。4.2 在分子生物学中的应用
BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要 集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测以及将免疫 测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗 原的检测等方面。自从合成了生物素化的脱氧三磷酸脲苷 (dUTP)和UTP等核苷酸单抗以来，以生物素化多核苷酸为 探针的核酸杂交技术有了很大发展，常用于Southern、 Northern和原位杂交等。试验时，标记探针先与细胞或染 色体原位(或是固定在乙酸纤维素膜上)的变形核酸分子进 行杂交，然后用偶联了酶或荧光物质的亲和素(或链霉亲 和素)识别杂交互补片段，使其显色或产生荧光，这种技 术克服了放射性核酸探针标记与检测的缺点，应用潜力很 大。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
4.1.3在胶体金技术中的应用 BAS应用于胶体金技术，其原理为带正电荷的链霉亲 和素标记的带负电荷的胶体金颗粒能与生物素紧密结合， 使检测信号在只有胶体金标记或只有BAS标记的基础上得 到扩大。吕丰等应用石英晶体微天平(QCM)研究了基于 BAS的葡萄糖氧化酶的固定化，结果在利用BAS固定过的 葡萄糖氧化酶过程中，经过纳米金颗粒修饰的QCM基片 对酶的吸附量比未经修饰的基片多。张志锋等以组装型金 磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共 价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离 生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能 力。
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
卵白亲合素
亲合素
链亲合素 卵黄亲合素 类亲合素等
后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。
二 原理
20世纪60年代初发现了生物素(biontin，B)和卵白素(avidin，A)， 其亲和力至少比抗原-抗体结合力高百万倍，是目前发现的自然界中 具有最强亲和力的物质。
每个 分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物 活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子 又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。常用的有亲和素-生物素标记法(Labeled avidinbiotin，LAB)、亲和素-生物素桥法(bridged avidinbiotin, BAB)和 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidinbiotinperoxid ase complex，ABC)。 生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发 展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并 与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步 提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、 定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
亲和素：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大， 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。