Fluorescence Microscope；LSFM）
以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭
聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的 荧光显微镜系统
共聚焦系统 细胞CT
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荧光和荧光显微镜
一、荧光的基础术语
荧光物质：
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发 出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能 产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)：
白即绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。
Ca2+
Aequoren + 肠腔素
蓝色荧光
GFP
绿色荧光
GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒
1. 转基因动物: Green mouse
2. 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监 测外源基因的表达.
能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长)
488nm 520nm
发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长)
异硫氰酸荧光素(FITC)
荧光探针：
能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）
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三维胶原基 质培养的血 管平滑肌细 胞
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共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域
只要目的结构是用荧光探针标记的，都可 用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。
形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联 系、肿瘤细胞分类……
分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量， DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、 定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、 受体与配体相互作用……
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光源针孔 光源
聚集平面
光电倍增管 检测针孔
分色镜
物镜 样本
共聚焦扫描显微镜光学原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一 点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进 入检测针孔 高分辨率的光学切片
激光穿透性强，可对样本进行一定深 度光学断层，获得高标准的连续光学切片
实现三维重建
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活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+ 等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复 细胞连接间的信息沟通……
直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共 聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白
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1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递
Intensity
Before bleach
After bleach
90 min after bleach
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2 . 荧 光 能 量 共 振 转 移 ( Fluorescence Resonance Energy Transfer)
I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使
Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine
共聚焦激光扫描荧光显微镜
— 基本原理、应用及样本制备原则
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什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？
共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning
供体荧光素 受体荧光素
488nm 520nm
650nm
PPT学习交流供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
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III. 常用荧光共振转移探针对
FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共
振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振 转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现 荧光。 应用
Antivibration table 防震台
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
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共聚焦装置
X/Y扫描 装置
荧光显微镜 物镜
光电倍增管 检测 针孔 光源 针孔
步进聚焦电机
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Bio-Rad LaserSharp
系统操作，图像处理 3-D重建
受体与配体的相互作用：亚基的结合 与分离
大分子构象的改变
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Fluorescence Intensity
Ligand
Time
Cy5 Cy3
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3. 绿色荧光蛋白（GFP）
GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发 光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水 母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋
后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素， 能量的接受者叫受体荧光素。
II.荧光能量共振转移的条件
488nm 520nm
540nm 650nm
1.供体与受体间的距离 <10nm或=1-7nm
2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱 有实质性的重叠
供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
蓝
色的生
绿
物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):
组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理漂白(BLE NhomakorabeaCH)：
荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 — 漂白。
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荧光显微镜
二、荧光显微镜术的基本原理
高 压 汞 灯
滤镜 分光
被荧光
紫外 激发 探针染
450nm
490nm
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FITC
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共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置
Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置
Computer
计算机
Microscope 荧光显微镜
Laser and electronic Control Unit
激光光源及 控制装置