第一节
扫描电镜的结构和工作原理
一、扫描电镜的基本结构 1、 电子光学系统（镜筒） 电子光学系统（镜筒） 2、 信号检测及显示系统 3、 电源和真空系统
镜 中 图 像
（一）电子光学系统（镜筒） 电子光学系统（镜筒） 电子枪和透镜： 电子枪和透镜： 电子枪产生电子经透镜会聚成电子束（探针） 电子枪产生电子经透镜会聚成电子束（探针） 投射在样品表面( 投射在样品表面(约10nm) 偏转线圈） 扫描线圈:（偏转线圈） 位于透镜和物镜之间，有两组扫描线圈（ 位于透镜和物镜之间，有两组扫描线圈（在显 像管也有两组）作用是控制电子束在X 像管也有两组）作用是控制电子束在X、Y两个方 向规律的运动 样品室: 样品室: 样品室较大，位于物镜的下方，室内有样品台、 样品室较大，位于物镜的下方，室内有样品台、 二次电子检测器、 二次电子检测器、抽气管道和更换样品的窗口
取 材 充分暴露并保护好观察面 5mm） ↓ （10mm2×5mm） 清 洗 用生理盐水仔细漂洗观察面 ↓ 2%戊二醛和1%锇酸固定 戊二醛和1% 固 定 2%戊二醛和1%锇酸固定 ↓ 丙酮脱水， 脱 水 丙酮脱水，醋酸异戊酯置换 ↓ 干 燥 临界点干燥 ↓ 镀 膜 离子溅射镀膜或真空镀膜 ↓ 更多内容欢迎莅临天马行空官方博
（二）清洗 扫描电镜对样品表面的清洁要求十分严格 表面血液、 表面血液、粘液等必须清洗干净 可采用以下方法： 可采用以下方法： 1.等渗生理盐水或缓冲液仔细地漂洗 等渗生理盐水 1.等渗生理盐水或缓冲液仔细地漂洗 或用针筒反复冲洗 2.对粘液物质过分粘稠， 2.对粘液物质过分粘稠，难以去除的标本 对粘液物质过分粘稠 可采用酶消化 酶消化方法进行处理 可采用酶消化方法进行处理 3.用5%的苏打水清洗 3.用5%的苏打水清洗
扫描电子显微镜 （Scanning Electron Microscopy SEM） SEM）
材化0801 孟岩 李民 王洪志 张俊
扫描电子显微镜
（Scanning Electron Microscopy SEM） SEM）
1942年 1942年 60年代 60年代 80年代 80年代 90年代 90年代
二、扫描电镜的工作成像原理
＆ 电子枪发射电子，经透镜聚焦形成很细 电子枪发射电子， 的电子束班（ 10nm） 的电子束班（约10nm）称电子探针 ＆ 电子探针打在样品表面，把样品表面原 电子探针打在样品表面， 子外层的电子打落形成 二次电子 （二次电子的产生率主要与样品表面材料的性质及入
射角的角度有关，入射角越大， 射角的角度有关，入射角越大，二次电子的发射就越 多）
（一）取材 取材的基本要求和TEM 取材的基本要求和TEM样品制备相同 TEM样品制备相同 样品可大一些（ 高度可达5mm 5mm） 样品可大一些（8～10mm2，高度可达5mm） 扫描观察的部位常常是标本的表面 如气管表面、 如气管表面、胃、肠粘膜表面等 要把观察的结构暴露出来 对易卷曲的样品可固定在滤纸上 以充分暴露待观察的组织表面
第一台扫描电子显微镜 分辨率和图像质量的大大的改善 广泛应用于医学、 广泛应用于医学、生物学等领域 高分辨型扫描电镜的分辨率0.2nm 高分辨型扫描电镜的分辨率0.2nm
扫描电镜与透射电镜结构比较 1 照明系统结构和原理基本相同 都是由电子枪和聚光镜等来完成照明工作 SEM 没有中间镜和投影镜，但增加了 没有中间镜和投影镜， 二次电子探测器、扫描偏转线圈、 二次电子探测器、扫描偏转线圈、显像管等 SEM 样品室比 TEM 大，位置不同 SEM 与 TEM 真空系统、水冷系统和电源系统 真空系统、 的结构和功能基本相似。
样品台
1、含水量少的硬组织 此类样品一般含有硅质、钙质、角质等成分 此类样品一般含有硅质、钙质、 表面不易变形和收缩(如毛发、牙齿等) 表面不易变形和收缩(如毛发、牙齿等)
这类标本处理较简单，只需表面清洁， 这类标本处理较简单，只需表面清洁，就可 直接喷镀金属膜进行电镜观察
2、另一类是含水量较高的组织 这类组织在生物样品中占多数 大多数生物组织的含水量都在80% 80%以上 大多数生物组织的含水量都在80%以上 必须对样品进行特殊处理： 必须对样品进行特殊处理： 经固定、脱水、干燥、镀膜导电等过程 固定、脱水、干燥、
二次电子信息被收集转换和放大，变成 二次电子信息被收集转换和放大， 可供观察和拍摄的影像 由于二次电子产生的多少与电子束入射 角度及样品表面的起伏有关， 角度及样品表面的起伏有关，所以在荧光屏 上会得到样品表面形貌的立体图像
第二节
扫描电子显微镜样品制备技术
生物样品分为二大类: 生物样品分为二大类: 含水组织 含水量少的组织
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扫描电镜特点 景深长，视野广、 景深长，视野广、图像富有立体感 用于观察组织细胞的表面和断面的形貌 ●如细菌、血细胞、培养细胞的整体形态、大 如细菌、血细胞、培养细胞的整体形态、 小、表面突起和细胞间的相互关系 消化道、 ●消化道、血管等空腔组织的表面结构 ●骨等硬组织形貌以及生物材料的形状结构等
温 度，此时，液体的表面张力系数为零），物质不能以 此时，液体的表面张力系数为零），
液态继续存而要变成气体，这时的气体无论在 液态继续存而要变成气体， 多大的压强下都不会变成液体 利用液体CO 临界状态31℃ 利用液体CO2（临界状态31℃ ）置换醋酸异戊酯
（六）镀膜 生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不 生物样品经过脱水、干燥处理后， 带电，导电性能也差， 带电，导电性能也差，当入射电子束打到标本上 就会产生电荷的积累，形成充电和放电效应， 时，就会产生电荷的积累，形成充电和放电效应， 影响周围电子束的扫描和二次电子的发射， 影响周围电子束的扫描和二次电子的发射，严重 影响成像甚至无法成像 因此，必须给标本喷镀一层薄薄的导电金属， 因此，必须给标本喷镀一层薄薄的导电金属， 使样品具有导电性，增加二次电子发射量， 使样品具有导电性，增加二次电子发射量，提高 样品的亮度和反差。 样品的亮度和反差。 方法有：1.离子溅射法 方法有：1.离子溅射法 2.金属喷镀法 2.金属喷镀法等 金属喷镀法等
样品制备过程中必须注意的三个关键技术： 样品制备过程中必须注意的三个关键技术： 1、生物样品观察面的暴露 尽可能暴露出所观察组织的原貌 2、生物样品的干燥 在脱去组织中水分的同时又不引起形态的变形 3、生物样品的导电 使样品具有导电性并能得到清晰的二次电子像
常 规 样 品 制 备 程 序
SEM观察 SEM观察 客：/tmxk_docin
两极间加电场 后，产生辉光 放电 ↓ 气体电离产生 阳离子轰击阴 极金属靶 ↓ 金属原子溅射 出来飞向样品
阴极
● ● ●○●○○ ○ ←● ○ ●○ ○
气体
样品 阳极
2、金属喷镀法 在真空条件下把所要喷镀的金属加热 使其在真空下蒸发并喷射到标本表面 在样品表面形成一层金属膜使样品导电 常用: 常用: 金、铂、钯等
（三）固定 清洗后应立即固定 由于样品体积较大， 由于样品体积较大，固定时间应适当延长 （四）脱水 逐级增高浓度的丙酮或乙醇脱水 醋酸异戊酯： 互溶性很好） 然后进入中间液（醋酸异戊酯：与CO2互溶性很好）置换
（五）干燥 样品经脱水后， ★ 样品经脱水后，仍被脱水剂占有 必须除去脱水剂，使其真正干燥 必须除去脱水剂， ★ 干燥会引起样品体积变化和表面改变， 干燥会引起样品体积变化和表面改变， 要保存生物样品表面的微细结构又要使生 物样品达到干燥的目的就要避免表面张力 的影响 现有的方法： 现有的方法： 1、 临界点干燥法 2、 冷冻干燥法 3、 空气干燥法等
1.临界点干燥法 1.临界点干燥法 ▲ 目的是避免表面张力的影响，较好地保存 目的是避免表面张力的影响， 样品的微细结构 ▲ 利用物质在临界状态时表面张力等于零 的特性， 的特性，使样品的液体完全气化并以气体 方式排掉， 方式排掉，来达到标本干燥的目的
原理： 原理： 物质有固体、 物质有固体、液态和气ห้องสมุดไป่ตู้三种状态 通常以单相状态存在， 通常以单相状态存在，温度和压力改变时互 相转化 每一种物质都有所谓“临界状态” 每一种物质都有所谓“临界状态” （即临界
1.离子溅射法 1.离子溅射法 (Ion sputter) 将需要喷镀的金属制成阴极靶， ☆将需要喷镀的金属制成阴极靶，样品放在阳极上 容器内抽真空并通入一些惰性气体如氮、 容器内抽真空并通入一些惰性气体如氮、氖等 ☆两极间加电场后产生辉光放电 ↓ 气体电离产生的阳离子轰击阴极金属靶 ↓ 使金属原子溅射出来在电场的加速下飞向样品
(二) 信号检测及显示系统 二次电子探测器： 二次电子探测器： 由收集器、闪烁体、 由收集器、闪烁体、光导管和光电倍增管成 二次电子探器是扫描电镜的眼睛， 二次电子探器是扫描电镜的眼睛，其作用是 收集扫描样品发生的二次电子信号并将它变成显 像管的图像信号 显示系统： 显示系统： 显像管及电路组成， 显像管及电路组成，将电信号处理成最终影像 （三）电源和真空系统
制作人:
孟岩，李民，王洪志，张俊