Jilin Institute of Chemical Technology
吉林化工学院生物与食品工程学院专业实验
两水相萃取蛋白质的相图制作实验
摘要：目前在生化工业中常用的分离生物活性物质的方法,如有机溶剂萃取法等
存在着一定的缺陷,例如由于有相的变化或有机溶剂的变性作用使得生物活性物 质易于失活;在水—有机溶剂萃取中,界面上具有很强的界面张力,可破坏生物大 分子的结构。双水相萃取技术的发展趋势还体现在与其他生物分离技术的结合以 及萃取机理和热力学模型的优化上。 关键词：双水相萃取，蛋白质，分离纯化
(NH4)2SO4 （%）
20.00 37.50 48.57 57.14 61.19 64.77 67.86 70.29
微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不 用去污粉，可用铬酸洗液或洗涤液先浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷刷洗刻度 处，最后用蒸馏水反复冲洗数次。清洗干净的微量滴定管必须先用蒸馏水试漏，如有漏液， 可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、 支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍。3、由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液 放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴 定管使气泡从口部溢出。滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(NH4)2SO4 滴定时，在接 近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。
1956年，瑞典Lund大学学者A1bertson首次利用双水相萃取技术分离生物分 子，开始对A邛s进行比较系统的研究，测定了许多ATPs的相图，考察了蛋白质、 核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在ATPS中的分配行为，为发展双水相萃取技术奠定 了坚实的基础。20世纪70年代以后，Hustedt、Kula和Johanson等人将双水相萃 取技术应用于生物产品分离，他们从工艺流程、操作参数、成本分析等方面对双 水相萃取技术的工业应用进行了分析和尝试”。自20世纪80年代初期起，双水相 莘取技术开始应用于工业生产，国内也开展了相关研究”。 2双水相萃取技术的发展趋势 2．1 新型双水相成相材料的开发
extraction[J]．Journal of Chromatography A，2004(1025)：297—301． [5]Zea D V L Mayerhoff．In es C Roerto．Telma T Franeo．Purification of xylose reductase
from Candida mngii in aqueous two—ph“e systems[J]．Biochemical Engineering Journal．2004，18：217—223． [6]Smote Nitsawang，Rajni Hatti Kaul，Pawinee Kanasawud．Purification of papain from Cariea papaya latex：Aqueous two·—phase extraction VersUS two——step salt precipitation[J]．Enzyme and Microbial Technology，2006，39：1103-1107．
实验内容
I PEG／(NH4)2SO4两水相系统相图的制作。
一．实验目的和要求
了解用浊点法(Cloud Point Method)制作双水相系统相图的方法，加深对 相图的认识。
二．实验原理
两种亲水性高聚物或高聚物与无机盐在水中会形成两个相，这是由于高 聚物的不相溶性或盐析作用而引起的，但是，它们只有达到一定的浓度时，才能 形成两相。两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是一根双节线 (binodal)当成相组分的配比取在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后，溶 液澄清透明，称为均相区；在曲线的上方时，能自动分为两相，称为两相区，若 配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。相图是研究双水相萃取 的基础。
三．操作方法
1、溶液配制
配制 43.0 ％(g／ml)的(NH4)2SO4,溶液：精确称取(NH4)2SO4 固体 430.0 g,用 少量水溶解后稀释到 1000 ml，并用密度计测定其密度。
2、相图的制作
精确称取 PEG400 液体 0．700 g 左右于试管中，按表(5－1)中所列第 1 号数 据，加入 0．5 ml H2O( H2O 的密度以 1 g／ml 计 )，用滴定管缓慢滴加已配好的 (NH4)2SO4,溶液，并不断在混和器上混和，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶 液开始出现浑浊为止。记录(NH4)2SO4 的加量(ml)，根据密度值求出重量(g)。然 后，按表格所列第 2 号数据加入 H2O，使其澄清(加 H2O 量根据点子的密集程度 控制)，继续向试管中滴加(NH4)2SO4 溶液，使其再次达到浑浊，如此反复操作。 计算每次达到浑浊时，PEG 和(NH4)2SO4 在系统总量中的重量百分含量(％)，实 验数据填入表格中，以 PEG 的百分浓度为纵坐标，(NH4)2SO4 百分浓度为横坐 标作图，即得到一条双节线的相图。
在生物分离工程中常用的A口s有两类：非离子型聚合物／非离子型聚合物／ 水系统和非离子型聚合物／无机盐／水系统。在实际应用中，这两类A什s各有优 缺点：前者体系对生物活性物质变性作用低、界面吸附少，但是所用的聚合物(如 葡聚糖)成本较高，而且体系黏度大，在工业化大规模生产时从经济角度丧失了 该系统的优势；后者成本相对低，黏度小，但是由于高浓度的盐废水不能直接排 人生物氧化池，使其可行性受到环保限制，且有些对盐敏感的生物物质会在这类 体系中失活。因此，研究成相材料、建立新型ATPs成为双水相萃取技术的主要发 展方向之一。 2．2双水相萃取技术与其他生物分离技术的集成
双水相萃取技术与其他相关的生物分离技术进行有效组合，实现了不同技术 间的相互渗透、相互融合，充分体现了集成化的优势，进一步提高分离效率或解 决各自存在的难点问题。双水相萃取与相关技术的集成可以归纳成为以下3个方 面：a．与温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、气溶胶技术等常规技术实 现集成化，改善了双水相萃取技术中诸如成相聚合物同收困难、相分离时间较长、
分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质一直是项艰巨的工作。由于蛋白质的 市场价格昂贵，提高回收率能带来巨大的经济效益，所以有关蛋白质在分离纯化 中的失活及其对策在近年来受到很大的关注。双水相萃取是通过溶质在两水相之 间分配系数的差异而进行萃取的技术，其应用于蛋白质的分离纯化具有以下优势： 体系含水量高．可达80％以上。萃取环境和操作条件温和，蛋白质在其中不易失 活；界面张力远远低于水一有机溶剂两相体系的界面张力，有助于强化相际闸的 质量传递；易于按比例放大和进行连续性操作等⋯。正是由于双水相萃取技术的 诸多优势，现已被广泛用于蛋白质的分离纯化，取得了很好的成效。近年来，双 水相萃取技术的分离对象进一步扩大，已包括了多肽、氨基酸、植物有效成分、 重金属离子和抗生素等。 1 双水相萃取技术在生物分离工程中的应用
1
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易乳化等问题，为双水相苹取技术的进一步成熟、完善奠定了基础_b．与色谱技
术等新型生化分离技术实现过程集成，充分融合了双方的优势，既提高了分离效
率，又简化了分离流程Ic．将生物转化、化学渗透释放和电泳等技术引入双水相
分配，给已有的技术赋予了新的内涵，为新分离过程的诞生提供了新的思路”。
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吉林化工学院 生物分离工程专业实验报告
课程类型： 生物分离工程实验
实验类型：
设计型实验
学年学期：2015-2016 学年第一学期
试验时间： 2015.10.8-2015.11.20
班 级：
学 号：
实 验 者：
合 作 者：
指导教师：
提交日期：2015 年 11 月 29 日 吉林化工学院
[7]Chang W J，Keo Y M．Recovery of 13-galactosidase from Ecoil double lysogen using aqueous two—phase system[J] Biotcehnol Tech．1998．12：455—457．
4
参考文献 [1]孙彦．生物分离工程[M]．北京：化学工业出版社．1998．64． [2]Albertsson PA chmmatography and panitjon of cells柚d cells and cell fragments
3
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[J]Nature，1956，177：77l～774， [3]谭大伟，沈忠耀．双水相萃取分离技术的评价和展望[J]．微生物学通报，1996，23(6)． [4]S Teotia，M N Gupta Purification of phospholipase D by two-phase affinity
Hale Waihona Puke 四、结果与分析表（5－1）相图制作表
2
PEG 400= 0.7 克
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次数
1 2 3 4 5 6 7 8
H2O 加量 （g）
0.5 0.3 0.3 0.3 0.5 0.5 0.5 0.5
(NH4)2SO4 溶 液加量 （g）
0.3 0.6 0.8 1.1 1.3 1.6 1.9 2.1
纯(NH4)2SO4 累计量（g）
0.3 0.9 1.7 2.8 4.1 5.7 7.6 9.7
溶液累计
总量（g）
1.5 2.4 3.5 4.9 6.7 8.8 11.2 13.8
温度 T＝
PEG400 （%）
46.67 29.17 20.00 14.29 10.45 7.95 6.25 5.07
20 ℃