高灵敏度的检测系统该系统是为了适应HTS而出 现的检测仪器。
高特异性体外筛选模型指用于检测药物作用的实 验方法。由于HTS要求反应总体积小,而且反应具 有较高的特异性和敏感性,因此对于筛选模型也 要求较高,常用的筛选模型都建立在分子平台和 细胞水平平台上,观察的是药物与分子靶点的相 互作用,能够直接认识药物的基本作用机制。目 前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种 细胞反应方面。
多粘菌素E高产菌株的高通量筛选
.42.1.1菌种 多粘菌素E产生菌:多粘杆菌(paeni石aeillus夕 oyl理琳a)Asl.541 生物检定菌:大肠杆菌(丑eoli)JMlog
4.22方法
4.2.2.1诱变育种
将制备好的pp口今巩堆。Asl.J4]菌 悬液用磷酸缓冲液稀释至105个url/, 取2ml与0.2ml浓度为5mg角11NTo混 合,30℃振荡处理60min,稀释涂布于含 多粘菌素E标准品500mg几的平板上, 置于30℃恒温箱中,培养30h。
此外最有价值的抗生素是应该是可溶的， 化 学性质稳定，可以口服和系统性应用的。
作用
抗生素在杀菌、创伤手术、 癌症化学治疗以 及老人或免疫受损患者的治疗等方面， 都有 良好的控制感染的功能
作用机制
抗生素等抗菌剂的抑菌或杀菌作用，主要是 针对“细菌有而人（或其他动植物）没有” 的机制进行杀伤，包含四大作用机理，即： ①抑制细菌细胞壁合成 ②增强细菌细胞膜通透性 ③干扰细菌蛋白质合成 ④抑制细菌核酸复制转录。
HTS主要由自动化操作系统、高灵敏度的检测 系统、分子细胞水平的高特异性体外筛选模 型、被筛样品管理库(即样品库)、数据采集传 输处理系统等五个部分组成。
自动化操作系统主要是指计算机控制的实验 室自动化工作站,又称实验室机器人。该工作 站可以代替人工进行自动加样、稀释、转移、 洗脱、混合、温孵、检测等操作,使实验遵守 程序化,减少人工误差,结果更准确可靠。
4基于竞争的抗生素筛选方法
基于竞争的抗生素筛选方法，通过将病 原微生物与人源细胞共同培养，用以筛选高 效低毒的化合物。该方法的优点是筛选仅需 一轮；并通过检测由人源细胞发出的信号(非 微生物发出的信号)，以监测化合物的作用效 果，这意味着可以不需要对病原微生物进行 基因修饰，简化繁琐的筛选步骤。
5.高通量筛选技术
被筛样品管理库(即样品库)对大量样品进行筛 选是发现新药的基础,国外进行药物筛选的机 构都已储备了数以万计的化合物,建立了相当 规模的样品库。
微生物领域中的应用
以微孔板为操作平台的高通量筛选技术也 广泛应用于包括天然抗菌化合物的筛选、敏 感性微生物作用方式的确定、微生物吸附机 理的确定、生物膜抑制的定量分析等研究工 作。
2.以微生物细胞分裂为靶标的抗生素筛选方法
抑制细菌细胞增殖即抑制细菌的细胞分 裂，这一过程有一系列蛋白和细胞因子调节 和协调，包括一种Fts蛋白家族。FtsZ蛋白的 浓度可以调节细胞分隔的频率，小幅度的浓 度升高可以使得细胞结构发生微小变化，大 幅度的浓度升高可以导致细胞丝化甚至菌体 死亡。影响FtsZ蛋白作用机理或生成的化合物， 将是很好的候选药物。通过抑制FtsZ来抑制细 菌细胞分裂。使得FtsZ成为一个抗生素筛选的 有效靶点。
4.2.2.296微孔板培养
于无菌96微孔板各孔中加入200川斜面培养基,待 凝固后,将诱变平板上长出的单菌落转接于各孔 中,置30℃恒温培养24一28h。采用12道孔的排枪 将%孔板上长出的单菌落接种于装有500闪发酵 培养基的%微孔板,于30℃,300prm微孔板摇床培 养32h,同时将原孔板上的菌落转接于另一微孔板, 同样条件下培养后作为备份。在无菌条件下,将 培养后发酵液于4800prm离心10mni,得到上清液。
通过干扰控制反应的目的基因
1.2 可调型表达筛选
各种理论上的顺反子用来调节表达的反义RNA， 可以在基因组范围内寻找细菌细胞壁合成必须基 因。一个必须基因精确的减量调节，可以使该基 因产物对其抑制剂敏感，可以用来筛选新的抑制 剂。
布迈施BMS (Wilmington等)在靶基因上游插入一 个严谨型调控的阿拉伯糖启动子，可以使细胞壁 合成对抑制剂超敏化，如大肠埃希菌中的murA 基因。5种murA的抑制物已经发现，这些抑制剂 的抗菌活性表现在对murA的抑制。
抗生素筛选
姚坤志 2020.11
抗生素的定义
抗生素：由微生物（包括细菌、真菌、放线 菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的 具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产 物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物 质。临床常用的抗生素有微生物培养液中的 提取物以及用化学方法合成或半合成的化合 物。
优良的抗生素一般具备两个特性: ①能够抑制细菌细胞中关键的代谢途径; ②通常可以改造和修饰，以筛选出具有更多 理想性能的具有抗菌活性的类似物。
高通量药物筛选广泛用于药物先导物的筛 选。我们通常所说的高通量药物筛选平台是 由化合物库、 靶体选择、 靶体和化合物反应 的测试方法的建立、 靶体作用物的高通量筛 选和数据的信息处理系统这几大部分组成。 它的目的是通过对种类繁多的化合物作针对 各种药物靶体的筛选, 从中寻找最佳的先导化 合物。其特点是规模大、速度快、成本相对 较低, 缩短新药开发周期并可找到最佳新药。
4.2.2.396微孔板生物测定
于装有300川大肠杆菌悬液的微孔板中加入5 川发酵上清液。于每块孔板
的空白对照孔中加300川MH培养基,生长对照 孔中加300川大肠杆菌悬液。 经37℃,200prm培养12h后,采用微孔板读数计 测定600nnl下各孔培养液的 OD值。以出发菌株培养液的抑菌活性为参照, 即可筛选出阳性突变株。
5.2.3检测技术
该系统是为了适应HTS而出现的检测仪器。 放射性检测方法的建立,特别是SPA检测方法的 应用,使进行的小样本量实验得到发展,促进了 高通量药物筛选的实现。目前比较新的技术 有:时间分辨荧光分析、时间分辨荧光能量传 递分析方法等,这样高灵敏检测方法的出现,使 精确检测几十微升甚至几微升的样品中的变 化成为了可能。表1列举了已经商业化的高通 量检测技术平台。
3.3以QseC为靶标的抗生素筛选方法
很多细菌性病原体，依赖于细胞膜上一种保 守的蛋白激酶QseC，以对宿主的肾上腺素能信号 分子和细菌的信号作出反应，来提高毒力因子的 表达。Rasko利用高通量筛选发现了一种小分子 LED209可以抑制信号与QseC的结合，来抑制其 自身磷酸化和抑制接下来的QseC介导的毒力因子 基因的表达。LED209对细菌是无毒的，也并不抑 制病原体的生长。但是这种化合物可以显著的抑 制许多病原体在体内和体外的毒力。信号的抑制， 为发展广谱的抗菌药物提供了新的策略。
由于近年来过量和过度使用，造成了抗生素 耐药菌的快速进化和传播， 对我们控制细菌耐药的一条有效途径。随着新 抗生素的数量不断增加发现新抗生素越来越 困难,而临床上绿脓杆菌和耐药菌的感染逐年 严重,又需要一些新抗生素用于细菌感染的治 疗。因此抗细菌抗生素的筛选方法研究受到 重视。
孔的微孔板是高通量筛选技术的主要操作平 台。
5.2.2移液技术
微量水平上快速而又精确的液体取样技术是高 通量筛选技术必不可少的技术之一。目前用于亚 微孔板的液体移取及分配技术主要有三种类型: 空气置换式、钉式、点滴式。空气置换式的移液 器的工作原理与泵相似,能用于0.5一100微升取样 范围。钉式移液器则借助毛细作用及表面张力, 具有兆升一纳升级水平的移液功能,其缺点是各 孔道取样存在10一30%的偏差。点滴式移液技术 的工作原理与印刷业中的墨喷射机理一致。它也 能达到纳升级的移液水平,而且多孔道之间的偏 差小于10%。
5.2高通量筛选技术进展
高通量筛选的核心技术包括微型 化的操作平台、高通量的移液技术 及高效的检测方法。
5.2.1微孔板操作平台
目前,各种型号的微孔板市场上均有销售。 标准化的型号有6孔、12孔、24孔、45孔、96 孔、354孔和1536孔。根据孔底形状可分为圆 底、平底、锥型及U型底微孔板。根据孔的深 浅可分为浅层和深层孔板。其中96孔和384
5.1高通量筛选技术简介
高通量筛选(High torughput screening, HTS) 技术是20世纪80年代发展起来的一种用于新化 合物开发及目的菌种选育等方面的高新技术。 它的基本特点是以微孔板为载体,采用高密度、 微量自动化加样的方法,能快速平行地测试大 量样本。高通量技术兼具平行化、自动化、微 量化及集约化的优点。
筛选流程
抗生素的筛选流程通常包括以下三个步骤: ( 1) 分离和培养生物体 ( 2) 抗生素的检测 (3)抗生素物质的化学描述及结构鉴定。
传统的筛选方法
筛选流程通常是依赖有效的工厂式的操 作, 微生物学家在筛选过程中根据生产菌株的 形态学和它们的抗菌谱挑选分离出许多链霉 菌用来生产抗生素和作为可能产生新的抗生 素的候选者, 然后抗生素物质被提纯、 描述和 鉴定。
以微孔板为操作平台的高通量技术最早于
1951年引入,主要用于分析性试验，随着对微孔板 体系下各种反应及培养过程控制参数深入了解,为 微型化技术的可行性奠定了理论基础。以前在平
板、试管或者摇瓶上进行的各种化学反应及菌体 培养均可在微孔板上执行,且一块微孔板上提供了 大量具有相同形状和流体动力学特性的微型化反 应器。同时,与微孔板配套的各种多通道实验装置 的出现,如多孔道移液器、多孔道液体分配器、微 孔板离心机等,为微型化高通量技术的建立奠定了 技术基础。
4.2.2.4复筛
根据初筛结果,从保藏孔板上挑取高产单菌落 接种至新鲜斜面上。从培养 成熟的斜面上接种至种子瓶,待种子长至对数 生长期(24h左右)时接入装有 30ml发酵培养基的250ml摇瓶,接种量10%,平 行三瓶。30C0,300甲m培 养32h后进行HPLC产量测定。
谢谢！
3.1以微生物核糖体为靶标的抗生素筛选方法
Yassin等利用遗传学的方法来鉴定核糖体 上决定其功能和结构的位点，这些位点可以 作为药物作用的新靶标。利用随机突变rRNA 基因的方法，绘制了一张rRNA位点图，这张 图包括rRNA上一些突变后会损害核糖体功能 的位点，和一些突变累积可以导致有害表型 的多个位点。他们在23S rRNA上共绘制了77 个有害突变的单个位点，并按其对表型的损 害程度将这77个位点排列。通过干扰微生物 核糖体功能来抑制细胞生长的。