食品中致病性弧菌的检测和计数该NMKL法尚未经协同研究证实1.适用范围本法可用于检测和计数食品中的副溶血性弧菌，霍乱弧菌，刨伤弧菌和溶藻弧菌。

这些对人类有致病性的弧菌可能由粪便污染或水源受到污染而在食品中出现。

在食品，尤其是贝类、蜊蛄和鱼的微生物学控制和与疾病爆发有关的微生物学调查中可能需要对该菌进行检测。

2.定义弧菌是兼性厌氧，有动力，革兰氏阴性，常呈逗号形的杆菌。

钠离子是大多数菌株（霍乱弧菌除外)所必需的一种生长因子。

大多数菌种为氧化酶阳性，过氧化氢酶阳性，发酵葡萄糖不产气。

它们一般出现于盐浓度范围较宽的水域环境及海洋动物的表面和肠道中。

一些菌株也可在淡水中发现(霍乱弧菌)。

副溶血性弧菌呈现下列的生物化学反应模式：氧化酶阳性，在42℃生长，精氨酸脱氢酶阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，不发酵蔗糖但可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

可发酵糖类但不产气。

在盐(氯化钠)浓度为6％时不能生长。

霍乱弧菌有如下的生物化学反应特性：氧化酶阳性，在42℃生长，缺少精氨酸脱氢酶，发酵蔗糖，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

在无钠离子时可以生长。

在盐浓度为3％时可以生长，而盐浓度为8％时不能生长。

创伤弧菌呈现如下的生物化学反应模式：氧化酶阳性，在42℃生长，缺少精氨酸双水解酶，赖氨酸脱羧酶阳性，不能发酵蔗糖但可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

在无盐或盐浓度为8％的培养基中不能生长。

溶藻弧菌见表1。

所有弧菌在不同程度上都会受到0／129弧菌抑制剂(0／129 Vibrostaticum)的抑制。

3.参考文献NMKL Method No.91，2nd ed.1988：Pretreatment of foods for microbiological examination.NMKL Report No.5，2nd edition，1994：Quality Assurance Guidelines for Microbiological Laboratories.4.原理将欲检测该菌的已知量的食品接种于一种液体选择性培养基中，培养后涂布样品于一种固体选择性培养基上。

可疑菌落经进一步生物化学检验。

此外，可将已知量的可疑食品直接接种于一种选择性固体培养基上进行定量测定。

5. 培养基和试剂5.1稀释剂将8.5g氯化钠和1.0 g蛋白胨溶于1000mL蒸馏水中并煮沸，调节PH使之灭菌后25℃为7.0±0.2。

分装稀释剂于试管或广口瓶中以使12l℃高压灭菌20min 后分别含9.0±0.2ml和90±2ml。

5.2液体选择性培养基5.2.1含2％盐的碱性蛋白胨水酵母浸膏3g蛋白胨10g氯化钠20g蒸馏水至1000ml高压灭菌后25℃时PH为8.6±0.2。

倾入250ml的锥形瓶中，每瓶200ml，121℃高压灭菌15min。

5.2.2. 盐多粘菌素肉汤酵母浸膏3g胰蛋白胨10g氯化钠20g蒸馏水至1000ml将各成分加热溶解，调节PH以使灭菌后25℃时最终PH为8.6±0.2。

121℃高压灭菌15min。

使用前加入多粘菌素B，250IU／ml。

当检查含菌量较低的食品时，仅加25IU／ml。

倾入250ml的锥形瓶中，定性测定时每瓶200ml，5℃以下保存。

5.3.固体选择性培养基5.3.1.硫代硫酸盐柠檬酸盐蔗糖琼脂(TCBS)蛋白胨l0g酵母浸膏5g柠檬酸钠l0g硫代硫酸钠l0g牛胆汁，干的5g脱氢胆酸钠3g蔗糖20gNacl l0g柠檬酸铁1g麝香草酚兰0.04g溴麝香草酚兰0.04g琼脂14g蒸馏水至1000ml加热溶解各成分，25℃时调节PH至8.6±0.2。

煮沸灭菌（不是高压灭菌）15min。

5.4.用于对纯培养的可疑细菌进行诊断的培养基，抗生素试验和试剂5.4.1.Hugh-Leifson, 盐葡萄糖培养基(O／F培养基)蛋白胨2g氯化钠20g磷酸氢二钾0.3g溴麝香草酚兰0.08g琼脂 2.5g蒸馏水至1000ml25℃时调节PH至7.1+0.2, 121℃高压灭菌15min。

加入l0ml含l0g葡萄糖的水溶液（过滤除菌）。

5.4.2.胰蛋白胨肉汤胰蛋白胨10g氯化钠20g蒸馏水至1000ml将各成分溶于水中121℃灭菌15min。

5.4.3.弧菌抑制剂（Vibrostaticum）将菌株越过血琼脂(5.4.4)直径划一条线接种(8.5.3)后，在该划线上放一含150 μg二氨基二异丙基碟啶的0／129弧菌抑制剂园纸片。

5.4.4.血琼脂蛋白胨10g肉浸膏5g氯化钠7g琼脂15g蒸馏水至1000ml在25℃调节PH至7.4±0.2，121℃高压灭菌15分钟，然后于45±1℃水浴中冷却，加入加热至同一温度的5％脱纤维蛋白的小牛血。

倾注陪替氏皿前小心地将血与熔化的培养基混合。

该血必须来自小牛或幼牛。

5.4.5.氧化酶试剂盐酸对氨基二甲基苯胺(TMPD) 1.0g抗坏血酸100mg蒸馏水100ml将抗坏血酸溶于冷水中并加入1gTMPD，加约5～8m1该试剂于试管中，然后将其冷冻。

用前将试剂融化并用银纸包裹避光，在这些条件下氧化酶试剂可在冰箱中保存约l周。

也可使用商售的氧化酶试纸条。

也可使用相当于5.4提供的各成分的脱水培养基，如使用这种培养基，必须确保培养基的盐浓度与此方法所规定的盐浓度一致。

6、仪器和玻璃器皿：6.1. 均质器，用于非液体食品样品6.2.培养箱，37.0士1.0℃，42.0±1.0℃6.3.灭菌的弯曲玻璃棒, 三角形7.抽样在无菌操作条件下，并按照使样品尽可能地代表被检产品的方式抽样。

抽取至少50g的固体食品和至少100ml的液体食品。

若抽取后1小时内不能进行接种，最好将样品保存在7~l0℃适度的冷藏条件下。

抽样后12h内必须进行接种，如存放较长时间，应在报告结果时对此加以说明。

8.操作方法：8.1.样品材料的预处理按NMKL No.91(3)所述，涂布平板前必须将非液体食品进行均质。

均质，稀释和接种必须尽快地进行，检验贝类时，开贝壳前必须用刷子进行清洗并用乙醇消毒。

开壳时用一把无菌的小刀按非冷冻的固体食品所述进行。

8.2.直接涂布在固体选择性培养基上的定量方法。

将0.1ml各十倍稀释液涂布于TCBS培养基(5.3.1.)上。

用一支灭菌的三角形玻璃棒(6.3)在表面上涂布均匀，接种了的平板于37.0±1℃培养2天，一天、两天后分别读数。

8.3.在液体选择性培养基中增菌的定性方法。

霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻性弧菌：接种20g食品于含盐2％的200m1碱性蛋白胨水中(5.2.1)42.0±1.0℃培养18±2h。

副溶血性弧菌：加20g食品于200ml盐多粘菌素肉汤(5.2.2)肉汤中，于42.0土1℃培养18±2h。

8.4.在固体选择性培养基上接种。

将一环接种于TCBS琼脂(5.3.1)表面上，平板于37.0±l℃培养24±3h。

8.5.读取和纯培养8.5.1.纯培养在原始选择性平板上纯培养24h后，以下类型的菌落被怀疑为弧菌。

霍乱弧菌：黄色，扁平，直径2-3mm；副溶血性弧菌：蓝绿色，直径3-5mm；创伤弧菌：蓝绿色，直径2-3mm；溶藻性弧菌：黄色，直径3-5mm；根据最初平扳上不同形态的菌落在血琼脂(5.4.4)上制备纯培养物。

纯化培养和鉴定至少5个可疑菌落。

如果怀疑存在不同弧菌，继续进行相应地分离和鉴定。

可按照表1进行最后鉴定，注意应向需要的培养基中补加1％的盐。

可在专门的实验室做进一步测定。

8.5.2.动力试验。

在胰蛋白胨肉汤(5.4.2)中检查动力，通过下列方法确定：a.直接用显微镜观察，或b.在添加0.5％琼脂于胰蛋白胨肉汤中制备的半固体琼脂中培养。

8.5.3.对弧菌抑制剂0／129的敏感性试验，用镊子将已放入冰箱浸湿了弧菌抑制剂1小时的一张圆纸片，放在划线接种后的平板(5.4.3)上，在37.0土1.0℃培养，24±3h后评价抑制结果。

8.5.4产气和产酸试验将O／F培养基(5.4.1)倾入试管中，用前在蒸汽流中将其溶化并立即在冷水中冷却。

用接种针穿刺到底部接种两支试管，其中一管用液体石蜡封形成厌气。

于37.0±1.0℃培养，每天观察产气和产酸情况直至四天。

厌氧和需氧管中均产酸(黄色)表明发酵(F)。

需氧管的上层产酸表明氧化(0)。

8.6.证实将用生物化学试验确定为霍乱弧菌的分离物送至专业实验室用O1和O139抗血清做最后鉴定。

9.结果的报告根据结果报告：20g样品中(或被分析的样品量)中检出或未检出弧菌。

如果进行了弧菌各种间生物化学区分，还应说明该种别，如20g样品中检出副溶血性弧菌。

如果进行了定量测定，则要报告每克食品中的弧菌数量，还要考虑到的稀释倍数。

10、实验室的卫生：由于某些致病性弧菌的感染剂量很低，要指出在工作中应特别小心，应该严格保持GLP。

例如，不能用嘴吸吸管。

11、方法的审定人本NMKL方法已由The Municipal Laboratory for Environment and Food Control,Aalborg,Denmark 的Maja kraglund Holfort 作了详细说明并得到了The Veterinary and Agricultural University,Frederiksberg,Denmark Niels Skovgaard的帮助表1各种弧菌的生物化学反应霍乱弧菌付溶血性弧菌创伤弧菌溶藻性弧落革兰氏染色- - - -动力***）+ + + +细胞色素氧化酶+ + + + Hugh和leifson***）F*/- gas F/- gas F/- gas F/- gas 在42℃生长***）+ + + +0/129弧菌抑制剂(150μg) + + + +还原硝酸盐为亚硝酸盐***）+**) + + +精氨酸脱氢酶***）- - - -赖氨酸脱羧酶***）+ + + + ONPG***）+ - + -由下列糖产酸--气：葡萄糖***）+ d - d蔗糖***）+ - - +纤维二糖***）- - + -嗜盐性：0%Nacl + - - - 6%Nacl - + + + 8%Nacl - + - + 10%Nacl - - - +*)F表示发醇。

**)表明偶有例外。

***)表示必须向培养基中加入1%Nacl。

+ 表示85-100％的分离物此特性为阳性。

d 表示16-84%的分离物此特性为阳性。

- 表示0-15%的分离物此特性为阳性。

译自《北欧食品分析委员会方法(NMKL)，№.156—1997(第二版)》。