❖ 溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸 的作用最为灵敏而且特异。因此被用于蛋白质的首 选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物， 加热可除去。
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实验材料
一、实验材料： 鸡卵清蛋白液，吸管（1mlx4，2mlx4，0.5mlx1， 5mlx2），试管（1.5x15cmx14），水浴锅，滴管，电炉
二、实验试剂： 苯酚（0.5%），米伦试剂，茚三酮（0.1%），尿素， NaOH（10%），硫酸铜（1%），硫酸铵固体，95%乙 醇，NaCl，醋酸铅，鞣酸，苦味酸，冰醋酸
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实验操作
❖ 颜色反应 ❖ 沉淀反应
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颜色反应按下图操作
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（二）双缩脲反应
❖ 当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一 分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。其在碱性条件 下双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称 为双缩脲反应。
❖ 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，此 类似反应也称蛋白质的双缩脲反应。凡分子中含有 两个以上肽键的化合物都呈此反应，故所有蛋白质 都能与双缩脲试剂发生反应。
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❖ 反应过程如下：
OO
H 2 N
H 2 N
C O+ CO
H 2 N
H 2 N
1 8 0 0 C
H 2 N N C C H 2 N +H N 3H
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（三）蛋白黄反应
在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如酪氨酸， 色氨酸等)残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的 硝基化合物，在碱性条件下生成物可转变为桔黄 色的硝醌衍生物; 此蛋白黄反应（以苯酚为例）为:
❖ 盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加，实 验时要加足够量的盐
❖ 蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋 白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释 时又可溶解
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（二）乙醇沉淀蛋白质
❖ 有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这 是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋 白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。若及时 将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可 重新溶解于水中。
C C O
O + 2NH3 + 2H2O
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二、蛋白质沉淀反应
❖ 蛋白质是亲水胶体，正常状态下，蛋白质分子表面具有水 化膜和双电层，能保持其胶体溶液的稳定性，在一定因素 的影响下，蛋白质会失去电荷和脱水沉淀。
❖ 蛋白质的变性与沉淀之间没有必然联系
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❖ 反应第一步:
O
CHale Waihona Puke OHC+
C
OH
O
O
C
H
C
C
OH
O
还原茚三酮
H R C COOH
NH 2
+ RC HO +
NH 3 + CO 2
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❖ 反应第二步:
O
C
H
C
+
C O
O C
OH NH2
CN
C O
O C C
C O
蓝紫色缩合物
O C
OH+ HNO3
HO
HO
NO2 + NaOH
O
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NO2 + H2O
OH N
OH
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（四）茚三酮反应
在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与 茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切 蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟 脯氨酸产生黄色化合物),含有氨基的其他化合物亦 可能发生此反应。
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（三）重金属盐类沉淀蛋白质
❖ 溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类(如 Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易与蛋白质结合成不 溶性盐而沉淀。
❖ 重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金 属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些 重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可 过量，否则将引起沉淀再溶解。此时的溶解为生成 憎水胶体的缘故。
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蛋白质沉淀反应
（一）蛋白质的盐析作用 （二）乙醇沉淀蛋白质 （三）重金属盐类沉淀蛋白质 （四）生物碱试剂沉淀蛋白质
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（一）蛋白质的盐析作用
❖ 加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白 质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电 荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉 淀析出的现象称盐析
实验一 蛋白质的性质实验
王伟 中国海洋大学医药学院
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实验目的
1. 加深理解所学有关的蛋白质性质的理论 知识
2. 掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量 分析的方法及原理
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实验原理
一、蛋白质呈色反应 二、蛋白质沉淀反应
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（四）生物碱试剂沉淀蛋白质
❖ 生物碱是植物中具有显著生理作用的—类含氮的碱 性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产 生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦 味酸和磷钨酸等。
❖ 当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离 子，能与生物碱试剂的阴离子结合成性盐而沉淀。
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一、蛋白质呈色反应
❖ 蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及 其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生 成有色物质的反应。不同蛋白质分子所含的氨基酸 残基不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全 一样。
❖ 呈色反应并不是蛋白质的专一反应。因此，不能仅 仅根据呈色反应的结果为阳性就来判断被测物质一 定是蛋白质，至少要用2种以上的方法来鉴别。
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蛋白质呈色反应
（一）米伦氏反应 （二）双缩脲反应 （三）蛋白黄反应 （四）茚三酮反应
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（一）米伦氏反应
❖ 蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝 酸的混和液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉 淀，此为酪氨酸的酚核所特有的反应，因此含有酪 氨酸的蛋白质均呈米伦反应。
1、米伦氏反应： Pr + 米伦试剂 2、双缩脲反应：
加热
白色沉淀
红色
3、蛋白黄反应：Pr + 3~4d浓HNO3观察，再加NaOH，再观察 4、茚三酮反应：Pr + 茚三酮（0.5ml）—（沸水浴）→ 观察颜色变化