模块九激光共聚焦技术1. 实验目的让学生了解激光共聚焦显微镜硬件组成，掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项，能够熟练、准确地设计光路，重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法以及钙指示剂（fluo-3/AM）标记Ca2＋的基本原理与方法，了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。

2. 实验原理激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。

激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。

激光扫描共聚焦显微镜基本结构（1）扫描模块扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。

荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。

（2）荧光显微镜系统激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。

（3）常用激光器激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型：多谱线Ar离子激光器（氩离子激光器）：发射波长为458 nm、477 nm、488 nm、514 nm的蓝绿光；He-Ne激光器（氦氖激光器）：发射波长为543 nm的绿光和633 nm的红光；UV激光器（紫外激光器）：发射波长为351 nm、364 nm的紫外光。

（4）辅助设备风冷、水冷冷却系统及稳压电源。

激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理：激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。

这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦图像，称为光切片。

3. 实验仪器激光共聚焦显微镜4. 实验试剂 百合花粉萌发液体培养基：1.27 mM CaCl 2；0.162 mM H 3BO 3；0.99 mM KNO 3；10%蔗糖。

fluo-3/AM 荧光探针（DMSO 配制，贮存液浓度1000 µM ）。

5. 实验步骤（1）激光共聚焦显微镜获得图象基本操作：启动激光共聚焦显微镜、软件和激光器；在VIS 模式中观察样品；转入LSM 配置；扫描图像；数据存储（2）激光共聚焦显微镜具体操作步骤：开机步骤：接通系统总开关。

显微镜、汞灯电源、温度控制器、除UV 以外的激光器，平时可以保持物理“开”状态，软件启动时才真正启动。

开启使用激光器的相应冷却系统，并使其运行大约15 min 后使用。

启动计算机，启动软件。

使用VIS 模式观察样品：设置物镜、反射镜类型，聚焦样品，定位于样品中心。

转入LSM 配置：启动激光器，配制光路。

滤色片参数（EF ：Emissions Filter ）。

LP XXX （Long Pass ，长通）波长大于 XXXnm 的光通过。

KP XXX （Short Pass ，短通）波长小于 XXXnm 的光通过。

BP XXX-YYY （Band Pass ，带通）波长在 XXXnm-YYYnm 之间。

的光通过。

BP XXX/YY 波长范围为 XXX nm ± YY nm 的光通过。

BP-IR （Band Pass – Infra Red ，带通－远红外）， 适于检测受远红外激发的染料的带通。

可以阻断远红外。

扫描，存储数据。

激光共聚焦显微镜工作原理示意图物镜 激光聚焦点F 样品关机步骤：将激光输出功率旋钮调节到最小；关闭激光器，保持其冷却系统继续工作10 min 以上再关闭开关；退出计算机操作系统，关闭计算机；关闭系统总开关；用擦镜纸蘸取少许酒精擦拭物镜镜头；显微镜光学系统冷却后，盖好仪器防尘罩。

（3）将已散粉的百合花药放入盛有5 ml 液体培养基的小培养皿中，盖好，放到脱色摇床上摇动，可使花粉从花药上脱落下来，并促其萌发。

（4）40 min 后，镜检其萌发情况，如视野中花粉萌发率已达80 ％以上，且大部分花粉管长度约为花粉直径的2-5倍，去掉花药，即可进行下一步探针标记实验。

（5）将在培养皿中培养好的花粉转移到1.5 ml 离心管中。

（6）短暂离心使花粉沉淀到管底，可重复几次以得到更多的花粉。

（7）弃上清，然后向管中加入200 µl 液体培养基，另加5 µl 探针(fluo-3/AM )（终浓度25 µM ），混匀，离心管需避光（可用锡箔纸包裹严实），对照管不加探针（其它各项与探针管相同）。

（8）将管放入装好冰的冰盒中，置于脱色摇床上振荡，孵育2h ，以使探针进入。

（9）短暂离心，弃上清，沉淀用培养液洗两次。

（10）室温放置1h （注意避光）后，可进行共聚焦显微镜观察。

（11）吸一滴放入载玻片，盖盖玻片。

（12）启动程序。

接通系统总开关，启动计算机，进入激光共聚焦使用程序，选择专家系统。

（13）荧光显微镜下观察。

进入荧光显微镜观察模式，选择物镜为fluar 40x/1.3Oil ，进入VIS 模式，使用双目显微镜在外荧光模式下聚焦样本，找到待测花粉管，并定位到中心部位。

（14）进入LSM 模式。

进入激光器控制界面，启动Argon/2激光器，首先点击standby 待激光器预热完成后点击on ，即激光器已经进入工作状态，并将输出功率设为60％。

设计光路。

图像扫描参数设置。

进行图像扫描。

扫描结束后，Palette 选为rainbow ，保存图像。

6. 注意事项荧光标记样品需要注意的问题：（1）荧光探针标记样品过程中注意防止样品结构的意外损伤和相关污染影响实验结果。

（2）荧光标记操作要避光进行，防止光敏效应引起的荧光淬灭或增强等变化；（3）荧光标记后要尽快上机采集图象，防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧激光共聚焦显微镜观察百合花粉管钙离子浓度梯度 图中右下角光谱自上而下为光强由强至弱光变化。

（4）为避免非特异性标记，正确设立对照组，防止假阳性或假阴性的出现。

荧光标记定量实验中经常出现的问题：（1）细胞荧光标记强度过高，甚至饱和，或刚好相反，即所有细胞荧光都很弱。

可能原因：所使用荧光探针浓度不当；标记条件不当，如样品与探针孵育温度或时间；荧光弱也可能是荧光探针失效等等。

克服方法：调整标记细胞时胞外荧光探针的浓度；改变标记样品的条件，如标记探针与样品的反应时间；检查探针是否失效，重新配制探针。

（2）“环岛效应”或“边缘效应”，表现为即连成片的细胞最外环的边缘的细胞荧光强度明显高于被包围在中间的细胞的荧光强度。

可能原因：染色时细胞接触染料的面积、生长在边缘和中间细胞的细胞膜状态不同，也可能因探针跨细胞膜能力不够、探针分布不均匀、标记的温度和时间等条件不当。

克服方法：①在不影响实验效果的前提下，尽量减低细胞种植密度；②由于染料浓度过高时更容易产生边缘效应，因此可以适当减低探针浓度；③适当延长标记时间，以使染料在细胞间达到充分的平衡时间；④染色后，上机前要进行充分洗涤附着探针（不需要洗涤的探针除外）。

附：其他荧光染料种类及应用（1）原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构常用荧光染料检测核酸：碘化丙啶（Propidium iodide, PI）；Hoechst 33342、Hoechst 33258和DAPI （4’, 6-diamidino-2-phenylindole）；丫啶橙（Acridine orange, AO) 等。

检测蛋白质、抗体及其他分子：FITC（Fluorescein isothiocynate, 异硫氰酸荧光素）、罗丹明（Rhodamine）、荧光蛋白（GFP、BFP、CFP、YFP、RFP）。

细胞器的位置及形态结构的观察：JC-1（Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide），罗丹明适用于线粒体；DAMP，Neutral red（中性红）适用于溶酶体；短链羰花青苷DiOC6（Dihexyloxacarbocyanine iodide）适用于内质网（非特异性）；NBD-Ceremide适用于高尔基复合体。

观察细胞骨架：如FITC或TRITC（TetramethylRhodamine Isothiocyanate，四乙基诺丹明异硫氰酸盐）单荧光标记的毒伞素。

检测细胞间缝隙连接通讯：罗丹明－葡聚糖（Rhodamine-dextran，RD）。

检测细胞内脂肪：尼罗红（Nile red）。

（2）活体细胞或组织功能的实时动态监测实时定量测定细胞内Ca2+变化：Fluo-3/AM，Fura-2。

测定细胞内pH变化：BCECF（2′,7′-biscarboxyethyl-5(6)-carboxyfluorescein，2′,7′-二羧乙基-5(6)-羧基荧光素），COFDA，SNARF。

检测细胞内活性氧的产生：DCFH-DA等。

7. 作业（1）Fluo-3/AM标记细胞内钙离子的原理是什么？（2）查阅相关文献，看看还有哪些其他的染料可以标记钙离子，其原理是否与Fluo-3/AM标记钙离子的原理相同。