核桃（核桃L.）水解蛋白的抗氧化肽的分离纯化和鉴定陈宁a,b杨红梅a,b孙毅a,b牛军a,b刘淑莹a,ca张俊应用化学研究所，中国科学院研究所，人民街5625号，长春130022，中华人民共和国b中国社科院研究生院，北京100039，中国人民共和国c长春中医大学，长春，中国人民共和国文章信息：二零一二年八月二十八日收到稿件二零一二年九月十四日收到修改稿件二零一二年九月十四日得到公认二零一二年九月二十六日在线可用关键词：核桃蛋白水解物、清除自由基的活性、纯化、抗氧化肽摘要：通过使用三种不同的蛋白酶水解核桃中的蛋白质，来得到抗氧化剂。
使用1,1 - 二苯基-2 - 苦肼（DPPH）法来测水解物的抗氧化活性。
其中胃蛋白酶水解物，水解3小时获得具有最高的抗氧化活性，因此可以抑制羟基自由基，亚铁离子螯合物，具有还原性与抑制过氧化脂质的能力。
然后，3小时的胃蛋白酶水解产物顺序通过超滤，凝胶过滤和反相高效液相色谱法纯化。
具有最高的抗氧化活性的肽序列被检测为丙氨酸- 天冬氨酸- 丙氨酸- 苯丙氨酸（423.23 Da）的RP-HPLC-ESI-MS，这首次被认定为来自核桃蛋白水解物。
最后，肽对脂质过氧化抑制作用类似于对还原型谷胱甘肽（GSH）的作用。
这些结果也表明蛋白水解产物和/或其有效分离的肽可以用作食品添加剂。
1介绍生物分子的氧化一直被被认为是自由基介导的过程，在所有生物体都是一个重要的反应。
自由基是原子，分子或离子的未成对电子或开壳层结构，如羟基自由基（•OH），超氧阴离子自由基（O2•- ）[6,34]。
过量自由基的合成，可导致细胞损伤和死亡，从而导致许多疾病，如癌症，中风，心肌梗死，糖尿病和主要障碍[2,4,21]。
因此，重要的是要抑制的过度自由基形成。
许多合成抗氧化剂如丁基化羟基苯甲醚（BHA），丁基羟基甲苯（BHT），没食子酸丙酯已被用来清除自由基[28,32]。
然而，使用合成抗氧化剂已很可能威胁健康造成肝损伤和致癌作用[9,23]。
因此，人们在从源代码中发现的天然抗氧化剂的兴趣与日俱增。
许多蛋白质水解物中的肽合物，如大豆蛋白[5,15]，鹰嘴豆蛋白[12,34]，小麦蛋白[18,35]，油菜籽蛋白质[17]，水稻胚乳中的蛋白质[33]，鱼蛋白[10,23,24,29,32]，蛋清蛋白[4,7]和牛蛙的皮肤[20]的抗氧化能力已得到评估。
这些水解物的抗氧化性能归于许多性能的共同作用。
包括他们清除自由基的能力，作为金属离子螯合剂，氧淬灭剂或供氢，抑制脂质过氧化的能力[4,12,15]。
一般肽包括3-20个氨基酸残基，并且它们的活性依赖于组成，结构和疏水性[4,5,19,26,27]。
核桃（核桃L.）是世界上最普遍坚果树[14]。
这是营养密集的食物，主要是由于其脂肪含量以及蛋白质，维生素和矿物质的比例构成。
一些生物活性，如抗动脉粥样硬化，抗炎和抗突变特性和抗氧化活性[14]，核桃中的以上成分一直被报道。
多酚和维生素E被认为是抗氧化活性[1,3]的主要来源。
然而，很少有实验尝试评估核桃蛋白的抗氧化活性。
在本研究中，蛋白质水解物和它们的核桃隔离的肽进行了调查。
此外，针对不同的自由基，其抗氧化效果进行了测试。
利用超滤，凝胶过滤色谱法和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）纯化抗氧化肽。
通过LC-MS/MS确定肽的序列。
2材料与方法2.1材料核桃是从中国吉林省当地市场购买的，中性蛋白酶和碱性蛋白酶从诺维信公司（北京，中国）采购。
胃蛋白酶获得来自鼎国生物技术有限责任公司（北京，中国）。
DPPH（1,1 - 二苯基-2 - 苦基偕腙肼）和GSH（L-谷胱甘肽减少），采购自西格玛化工有限公司的产品（圣圣路易斯，密苏里州，美国）。
乙腈（色谱纯）采购自费舍尔化工公司（NJ，USA）。
所有其他化学品所用试剂均为分析级。
2.2核桃分离蛋白（WPI）的产生用石油醚研磨并脱脂的核桃在50◦C时将脱脂粉在干燥烘箱干燥。
然后将脱脂的四个分散在比为1:15（重量/体积）NaOH溶液中（pH为9.0）并在45◦C萃取搅拌1小时。
调整pH值至4.5后，在4000×g通过离心分离得到的沉淀物20分钟，冻干在-20◦塑料袋中。
2.3制备核桃蛋白水解物（WPH）核桃蛋白分离物溶解在蒸馏水中浓度为30毫克/毫升，在pH7.0，50 ◦C使用中性蛋白酶，在pH8.0，50◦C使用碱性蛋白酶和在pH=2.0，37◦C使用胃蛋白酶水解4小时。
在0.5-，1 - ，2 - ，3 - 和4小时的间隔取出样品，并在沸水浴中加热，在100◦C进行10分钟以抑制酶活性。
然后以4000×g速度将样品离心15分钟，上清液冻干。
2.4抗氧化肽的分离纯化2.4.1超滤对于纯化的抗氧化肽，核桃蛋白水解物通过超滤膜的截留分子量（MWCO）3000沓（Millipore公司，美国）来分馏。
所有回收的馏分，冷冻干燥并命名为WPH-I（分子量>3 kDa 的）和WPH-II（<3 kDa的）。
2.4.2 凝胶过滤层析超滤分离后具有最高的抗氧化活性的馏分在蒸馏水中再溶解，然后使用Sephadex G-25凝胶过滤层析柱分离（10毫米×600毫米，玛西亚生物技术公司，新泽西州，美国）这被用蒸馏水以0.5ml /min速度溶出，并且可监测到280nm。
所期望的峰值的馏分组分被冻干并用来与抗氧化活性试验。
2.4.3 RP-HPLC凝胶过滤色谱分析后具有最高的抗氧化活性的馏分被进一步纯化为C18 DIAMONSIL 4.6/250柱（250毫米×4.6毫米内径，5m，迪马科技，大连，中国）。
该柱以乙腈线性梯度为（5-50％），含0.1％甲酸（FA）以1.0毫升/分的流速洗脱。
洗脱峰值在220nm处检测到级分，然后被馏分冷冻干燥。
2.5DPPH自由基清除活性蛋白水解物的DPPH自由基清除活性使用由张某等人描述的经过一些修改的方法进行测量[34]。
在96孔盘中将100·L WPH溶液加入到99.7％的乙醇的100 L的DPPH（0.1毫米）溶液中。
96孔盘涡旋混合10秒，且在25◦C温育30分钟且在吸光度NACH EN515 nm 处用酶标仪GENios（奥地利Tecan公司）。
乙醇取代的DPPH补充空白，同时使用蒸馏水代替样品用于控制。
DPPH自由基清除能力（DRSA）计算通过以下公式求得：DRSA (%)=﹡100（1）其中A样品，Ablank Acontrol样品的吸光度，2.6羟基自由基清除活性2.6。
羟基自由基清除活性羟基自由基清除活性（HRSA确定性的定义是使用Li等人描述的经过一些修改的方法[12]。
反应混合物含50L的2mM1,10菲罗啉，50 L的2mMFeSO4和30L 的0.2M磷酸缓冲液（pH7.4）与在96 - 孔板中20升的样品溶液（用作对照用相同体积的蒸馏水）混合。
过氧化氢（0.1％）加入到混合物中并温育在37度下进行60分钟，并用酶标仪GENios（T ecan 公司，奥地利）的结果，获得了使用以下的方程测量515 nm处的吸光度。
：高温合金（％）HRSA (%)=﹡100 (2)其中As为样品的混合物的吸光度，A1是吸光度对照组（蒸馏水代替样品）;A0是含1,10空白溶液的吸光度- 菲罗啉硫酸亚铁。
2.7还原性检测使用由yen和Chen [31]开发的测定方法测定水解液对铁（III）的还原能力。
将样品溶于蒸馏水中，生成在不同的浓度的溶液。
将等分试样（1ml）中的样品溶液与用2.5ml的0.2M 磷酸钠缓冲液和2.5毫升10毫克/毫升铁氰化钾混合。
将混合物温育在50◦C，30分钟，随后加入2.5ml的10％三氯乙酸溶液。
然后3000×g的速度离心混合物10分钟。
最后，2.5ml 的上清液混合2.5毫升蒸馏水和0.5毫升的0.1％的氯化铁水溶液和测得的吸光度在700nm 处（卡里50分光光度计，瓦里安，澳大利亚）。
减少比例配置是与反应混合物的吸光度成正比的。
2.8 Fe2 +的螯合作用Fe2 +的螯合是利用张某等人的方法测量[33]。
将FeCl2用1毫升m20和1毫升0.5mM 亚铁嗪试剂与0.5ml的等分试样混合。
在25◦C将反应混合物静置20分钟。
吸光度562 nm 处读取金属离子螯合活性，计算如下：金属离子螯合作用金属离子螯合作用=﹡100 (3)坯料的制备方式除了使用蒸馏水代替样品外是相同的。
EDTA作为阳性对照。
2.9抑制亚油酸过氧化根据大泽并木[16]的方法测定抗氧化活性。
简单地说，将样品溶于10ml的50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，并往10毫升99.5％乙醇的溶液中加入0.13毫升亚油酸。
然后用蒸馏水将总体积调整至25毫升，并将混合物放在加盖存储瓶孵育在40◦C黑暗环境中。
将反应溶液100 L与以上介绍的4.7毫升75％乙醇，0.1毫升30％的硫氰酸铵，0.1ml的0.02M 的氯化亚铁溶液与3.5％盐酸混合。
3分钟后，在500nm处读取吸光度。
2.10利用电喷雾串联质谱的肽的鉴定RP-HPLC纯化溶于H2O/acetonitrile（85:15，体积/体积）后的馏分具有最高的抗氧化活性，然后再将其装到Agilent 1200系列RRLC配备的一个反相柱（用Eclipse Plus C18，3.5 M，2.1毫米×150毫米，安捷伦科技，美国）。
流速设定为0.3毫升/分钟，柱温为30◦C。
流动相A为0.1％甲酸的水溶液。
流动相B为100％的乙腈。
为了样品分析，用作溶剂梯度如下5-70％B（0-20分钟），70％B（20-25分钟）。
质谱电喷雾电离源（ESI）在安捷伦6520 Q-TOF（安捷伦科技，美国）上执行。
正离子电离模式是在电压3500 V下进行的。
氮气雾化保持在40 psi和9升/分钟，在350◦C的蒸发温度。
.在350度下蒸发温度保持在40psi雾化和9升/分钟的氮是在。
数据被收集在m / z从100到2000的质心模式。
群峰查看器4.5（生物信息学解决方案公司，滑铁卢，ON，加拿大）结合使用手动用来处理MS/ MS 数据并进行肽序列从头测序。
2.11统计分析一式三份，所有的实验数据分析采用SPSS13.0软件（SPSS公司，芝加哥，IL，US 显著的差异有95％的置信区间（P <0.05）。
3结果3.1 WPHS制备及其抗氧化活性在最佳水解条件下对核桃分离蛋白分别用中性蛋白酶碱性蛋白酶和胃蛋白酶水来进WPHS制备及其抗氧化活性测试。
相对稳定的DPPH自由基已广泛用于测试化合物作为自由基清除剂或供氢和马尔萨斯的能力评估的抗氧化活性[12,25]。
较低的吸光度代表较高的DPPH自由基清除。