①基本操作液BS：Modified HTF+20%血清蛋白替代物（SPS）
② 预平衡液ES：以BS为基础液配制7.5%DMSO+7.5%EG ③玻璃化冷冻液VS：以BS为基础液配制15%DMSO+15%EG+0.5MSucrose
2.从原核到囊胚阶段胚胎的玻璃化冷冻
预平衡
玻璃化
囊胚冷冻前进行人工皱缩( 对滋养细胞层进行激光穿刺，使囊胚腔内液体流出，囊胚腔 塌陷，再进行冷冻减少冰晶的产生) 后再行冷冻。
Rienzi L, Gracia C, Maggiulli R, et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Hum Reprod Update. 2017 ;23(2):139-155.
保护剂毒性。 开放载体：交叉污染。
对细胞超微结构的影响：玻璃化冷冻时巨大 的渗透压变化及高浓度冷冻保护剂会引起滋 养细胞微绒毛数量的减少，对质膜、线粒体 和粗面内质网等细胞器都可能造成影响。 操作机械性损伤：人为技术熟练程度；激光 辅助也可能会因其热效应而影响胚胎发育。
六、胚胎解冻
4. 囊胚期细胞慢速冷冻流程
脱水程序
• 5%glycerol，10min； • 9%glycerol/0.2mol/L sucrose， 10min； • 装入含0.5ml 9%glycerol 0.2mol/L sucrose冷冻保护溶 液的冷冻管中。 • 上机。
降温程序
• 起始温度：+22℃； • 样品上机后开始降温:-2℃/min 直至-7℃； • -7℃稳定5min； • 手动植冰，停留5min； • 继续降温：-0.3℃/min直至32℃； • 样品下机，直接快速地放入液 氮中，然后转入液氮罐中保存。

2. 分裂期细胞慢速冷冻流程
脱水程序
• 0.5mol/L，PROH，5min； • 1.0mol/L，PROH，5min； • 1.5mol/L，PROH，10min；
• 1.5mol/L，PROH/ 0.1mol/L sucrose，10min； • 装入含1.5mol/L PROH 0.1mol/L sucrose冷冻保护溶液的麦管中； • 上机。
3. 玻璃化冷冻胚胎的复温
• 清洗液(WS)：mHTF+20%SPS； • 复温液(TS)：以WS为基础液配制1.0mol/L的蔗糖液； • 复苏液(DS)：以WS为基础液配制0.5mol/L的蔗糖液。
4. 玻璃化冷冻的优缺点
降温速度快(500～20 000℃/min)，无冰晶形 成； 耗时较短； 无需昂贵仪器； 复苏后存活率高。
6. 慢速冷冻缺点
•冷冻操作时间长； •需高度精确的程序化冷冻仪。
五、玻璃化冷冻技术
• 玻璃化冷冻：通过高浓度的冷冻保护剂在一定的降温
速率下，由液相直接转变成为一种玻璃状的固体状态的过 程。
1. 冷冻载体和试剂
• 冷冻载体：冷冻载杆(Cryotop)、冷冻薄膜 ( cryotop)、冷冻环(Cryoloop)、冷冻叶片 (cryoleaf)、拉细麦管(Open pulled straw)等。 • 玻璃化试剂：
降温程序
• 起始温度：+22℃； • 样品上机后开始降温:-2℃/min 直至-7℃；
• -7℃稳定5min； • 手动植冰，停留5min； • 继续降温：-3℃/min直至-32℃； • 取出样品，快速地放入液氮中， 然后转入液氮罐中保存。
3. 分裂期细胞解冻流程
• 31℃水浴1～1.5min； 快速解冻 • 将冷冻管静置于室温下5min。
胚胎冷冻技术
慢速冷冻法
快速冷冻法
玻璃化冷冻
超速冷冻
四、 慢速冷冻及解冻技术
• 依靠冷冻保护剂，慢速降温速率以及置冰 来减少和避免细胞内冰结晶的形成，以及 渗透压变化和温度变化对胚胎的打击。 • 可用于胚胎发育的各个阶段，如受精卵、 分裂期和囊胚期的胚胎。
1. 仪器及试剂
• 生物冷冻仪，麦管 • 试剂：PROH，PROH+Sucrose，glycerol
原核期时间短； 细胞较大，对冷冻技求高； 对原核期胚胎的发育潜能判断难度大。
• 卵裂期胚胎：Ⅰ-Ⅲ级
• 囊胚期胚胎：3CC 以上可利用囊胚。
囊胚冷冻优势:
囊胚期表面积与体积比大，对脱水复水造成的体积变化耐 受性好； 囊胚期细胞数多，损伤后修复能力强，少数细胞死亡后对 胚胎发育能力影响小。
5. 囊胚期细胞解冻流程
• 31℃水浴1～1.5min； 快速解冻 • 将冷冻管静置于室温下5min。
寻找胚胎
• 将溶液转入培养皿中，镜下寻找胚胎。
反脱水
• 5%glycerol/0.1mol/L sucrose，5min，室温； • 0.1mol/L sucrose，5min，室温； • 10%人血浆蛋白mHTF，5min，室温； • G2培养液中清洗4次； • 将胚胎转入G2培养液中，放进培养箱培养
胚胎冻融原理及技术进展
一、冷冻胚胎概念
• 采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎 在-196℃的条件下停止代谢，而升温后又不 失去代谢恢复能力的一种长期保存技术。
二、冷冻胚胎适应症
• 移植当日母体数据不达标，不适合移植； • 有多余胚胎。
缺点：冻胚复苏有可能导致降级或损失。
三、胚胎的选择
• 原核期胚胎
寻找胚胎
• 将溶液转入培养皿中，镜下寻找胚胎。
反脱水
• 1.25mol/L，PROH/0.2mol/L，sucrose，5min； • 1.0mol/L，PROH/0.2mol/L，sucrose，5min； • 0.75mol/L，PROH/0.2mol/L，sucrose，5min； • 0.5mol/L，PROH/0.2mol/L，sucrose，3min； • 0.25mol/L，PROH/0.2mol/L，sucrose，3min； • 0.2mol/L，sucrose，3min； • 6%血清培养液，清洗4次； • 转入6%血清培养液中，放进培养箱培养。
• 卵裂期胚胎存活标准：解冻2h 后有＞ 50%细胞完好透亮。 • 囊胚解冻存活标准：解冻培养后囊胚重新扩张到具有正常 内细胞团和滋养外胚层形态。
影响冻融胚胎存活的因素
• • • • 胚胎质量 冷冻保护剂 冷冻载体 冻融方法
玻璃化冷冻胚胎比程序化冷冻胚胎能获得更高的 冻融胚胎存活率、完全胚胎存活率及临床妊娠率。
卵裂期胚胎与囊胚期胚胎冷冻复苏 移植
临床妊娠率没有统计学差异； 囊胚期胚胎冷冻复苏移植的胚胎种植率优于卵裂期胚胎冷冻 复苏移植，流产率要高于卵裂期胚胎冷冻复苏移植。
Zeng M, Su S, Li L. e: a meta-analysis.J Assist Reprod Genet. 2018, 35(1):127-134.