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由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加 入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至 45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不 易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。 待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养 箱中培养。 5）计数 培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度 三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行 计算， 每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三 次重复的平均菌落数×稀释倍数×5
实验一 土壤中微生物的分离及 纯化（设计性实验）
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一、目的要求
掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的
基本操作技术。
学习平板菌落计数的基本原理和方法 。
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二、基本原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的 微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获 得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分 离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获 得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
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五、实验报告
1．结果 在你所实验的三种培养基平板上长出的菌落 分属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征 。
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六、思考题
1）在平板划线法（a）中，为什么每次都需将 接种环上的剩余物烧掉？ 2）为什么要将培养皿倒置培养？ 3)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才 能倒平板? 4)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关 键?为什么? 5)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而 是集中在一起时，你认为问题出在哪里? 6)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的 菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h) 后观察结果?
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2．平板划线分离法 （1）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号 笔标明培养基名称。 （2）划线 在近火焰处，左手拿皿底，右 手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一 环在平板上划线（图Ⅶ-5）。划线的方法很 多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过 划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个 菌落。
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也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的 食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培 养基，摇匀后制成平板，如图Ⅶ-1所示。最好 是将平板放室温2—3天，或 37℃培养24小 时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。
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（2）制备 土壤稀释液称取土样10g，放入盛 90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中， 振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌 分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土 壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸 三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌 吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml 无菌水的试管中，以此类推制成10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种 稀释度的土壤溶液。
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平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的 方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。 二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛 肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后 编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min， 或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸 管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度 编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌 液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～ 30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒 置37℃的恒温箱中培养24～48h。 涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜 ，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完 后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易 形成单菌落。
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（3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分 别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种 稀释度，然后用三支1ml无菌吸管分别由 10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各 吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中 ，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布 均匀，如图Ⅶ-2所示。
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菌落记数仪
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一般选择每个平板上长有30~300个菌落的 稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一 稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很 大，否则表示试验不精确。实际工作中同一 稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便 于数据统计，减少误差。由10-4、10-5、 10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌 落形成单位数也不应相差太大。 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度 是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第 二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落 数在50个左右为好，否则要适当增加或减少 稀释度加以调整。
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为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微 生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供 给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只 利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而 淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平 板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离 、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生 物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土 壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以 从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
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3）取样 用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和 10-6。的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的 无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。 不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释 菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重 复平板间的操作误差。 4）倒平板． 尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化 后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫 升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与 菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平 皿盖上。
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三、器材
高氏1号琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂培 养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的 试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环， 10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。 大肠杆菌菌悬液、 牛肉膏蛋白胨培养基。 lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无 菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
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四、操作步骤
1．稀释涂布平板法 （1）倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号 琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至 55—60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10 ％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液， 使每毫升培养基中含链霉素30μg/mL。然后分 别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持 盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手 拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指 、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的 培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指 中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培 养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约 15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀 分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。
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（4）培养 将高氏1号培养基平板和马丁氏培养 基平板倒置于28℃温室中培养3—5日，肉膏 蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2—3日。 （5）挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取 接种到上述三种培养基的斜面上，分别置 28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检 查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查 是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就 要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
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常用的划线方法有下列二种： 1）用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在 平板培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再 转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉 ，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线 ，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行 划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线 划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。 2）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续 划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。
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（3）挑菌 同稀释涂布平板法，一直到菌分纯 为止 3、平板菌落计数法 l）编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4 、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6 支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、 10-6。
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2）稀释 用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌 县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管 中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液 中。 将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混 匀。另取一支lml吸管插入10 1试管中来回吹吸菌 悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时 不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面 ，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外 溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放 0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。…… 其余依次类推，整个过程如图VIII-3所示。 放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能 接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果 误差较大。 2016/1/6 19
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平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后， 其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的 稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细 胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌 落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数， 根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中 的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分 散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来 自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计 数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计 数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位 (colony-forming units，cfu)而不以绝对菌 落数来表示样品的活菌含量。