没有及时固定引起抗原的扩散
立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换
有机(醇类)固定剂
固定不充分
过度固定 抗原修复无效
不兼容的二抗和一抗
漏用试剂或未按正确的顺序 加入试剂
二，高背景
可能的原因
一抗或二抗的浓度过高
相应的措施
预实验摸索最佳浓度 一抗孵育前封闭 (最好是二抗来源的血清) 在染色过程中避免组织干燥 用新鲜制备或购买的玻片进行实验
一抗和/或二抗与组织的
非特异性结合 组织过于干燥
试剂粘附在旧的
或未制备好的玻片上
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三，细胞/组织的形态被破坏
可能的原因
抗原修复方法过于剧烈
相应的措施
预实验摸索合适的修复条件 增加固定时间;烤片; 使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片
组织切片从玻片上脱落
组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡 使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
将细胞培养 至所需密度
加入4%PFA 固定10min
染色 或保存
PBS洗涤
PBS洗涤
实验步骤
二，细胞免疫荧光ICC染色
加入一抗 加入二抗 加入DAPI复染
PBS 洗涤 0.2% TritonX 处理5min
PBS 洗涤
PBS 洗涤
封闭
室温30min
4℃过夜
固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体
材料：
Hela细胞 细胞培养皿
仪器：
荧光显微镜
二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG
DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4
实验步骤
37℃1-2小时
37℃510min
荧光显微镜 观察
实验结果
三，观察
human HeLa cells
实验中应注意的问题
细胞不要铺的过密:60-70%
防止细胞污染 固定时间不要太长,一般10-30min TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 选择合适的封闭液 二抗孵育后,一定要洗干净 必要时用恒温摇床摇洗
细胞免疫荧光技术
实验目的

掌握免疫荧光技术的基本原理


熟悉细胞免疫荧光技术的方法
了解在免疫细胞化学技术中如何 获得好的实验结果
实验原理
原位检测 抗原抗体特异反应 间接法
抗体 抗原
显示荧光
激发光
荧光素标记 的抗抗体
Vinculin Hela细胞 间接荧光抗体染色法示意图
实验用品
试剂：
用什么仪器观察？
A
疑难解答
一，缺乏染色
可能的原因
无抗原 抗体失效
相应的措施
用原位杂交方法检测蛋白表达 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 增加固定时间或改用不同的固定剂 减少固定时间;抗原修复 增加修复时间或更换修复液 使用可以与一抗结合的二抗 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序
组织形态难以分辨
组织固定不充分,自发裂解
切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水 及时固定;增加固定时间; 提高固定剂/组织的比例; 将组织切得较小
四，染色不正确
可能的原因
固定方法对于抗原不合适
相应的措施
尝试不同的固定剂或增加固定时间 尝试改变抗原修复条件
抗原修复方法不合适
免疫细胞化学技术
1. 免疫荧光技术
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质 2. 免疫酶技术
3. 免疫亲和技术
4. 胶体金技术
免疫细胞化学技术注意事项
选择合适的方法 材料要留好 选择抗体 选择标记酶
封闭液的选择
设定对照实验
思考题
检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法，