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血涂片的制备与染色

血涂片制备与染色
血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程,微观上使细胞是由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。

血涂片的显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本步骤,特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断,具有重要价值。

血涂片制备是否合格、染色的好坏直接关系到检验结果的质量。

(一)血涂片制备
1.载玻片的准备
新载玻片常带有游离碱质,须用浓度为lmol/L的HCl浸泡24h,再用清水彻底冲洗,干燥后备用。

旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min,洗掉血膜,再用清水反复冲洗,最后用0.95L/L乙醇浸泡1h,干燥备用。

使用载玻片时,不要用手触及玻片表面,保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。

2.血涂片制作方法
取血液标本一滴置载玻片的一端,以边缘平滑的推片一端,从血滴前沿方向接触血液,使血液沿推片散开,推片与载玻片保持30~45○夹角,平稳地向前推动,血液即在载玻片上形成薄层血膜。

涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。

血滴大、角度大、速度快则血膜越厚;反之则血膜越薄。

一张良好的血涂片,要求厚薄适宜,头体尾明显,细胞分布均匀,血膜边缘整齐并留有的空隙。

(二)血涂片染色
染色的目的是使细胞的主要结构,如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色,以便于镜下观察识别。

血涂片染色包括两个过程:固定和染色。

固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固,以保持细胞原有形态结构不发生变化。

常用的染色方法有瑞特染色法(Wright)、姬姆萨染色法(Giemsa)等。

1.瑞特(Wright)染色法
为发观察细胞内部结构,识别各种细胞及其异常变化,血涂片必须嘲行染色。

血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。

目前常用瑞特染色法。

(1)瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。

亚甲蓝为四甲基硫堇染料,有对醌型和邻醌型两种结构。

通常为氯盐,即氯化美蓝。

美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。

市售美蓝中部分已被氧化为天青。

伊红通常为钠盐。

即伊红和伊混合后,产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀,即瑞特染料。

(2)细胞的染色既有物理的吸附作用,又有化学的亲和作用,各种细胞成分化学性质不同,对各种染料的亲和力也不一样。

因此,用本染料液染色后,在同一血片上,可以看到各种不同的色彩,例如血红蛋白,嗜酸性颗粒为碱性蛋白质,与酸性染料伊红结果,染粉红色,称为嗜酸性物质;细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染紫蓝色,称为嗜碱性物质;中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合,染淡紫色,称为中性物质。

(3)PH对细胞染色有影响。

细胞各种成分均不蛋白质,由于蛋白质系两性电解质,所带电荷随溶液PH而定,在偏酸性环境中下在电荷增多,易与伊红结合,染色偏红;在偏三性环境中负电荷增多,易与美蓝或天青结合,染色偏蓝。

因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感,染色用正经片必须清洁,无酸碱污染。

配制瑞特液必须用优质甲醇,稀释染色必须用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则可导致各种细胞染色反应异常,以致识别困难,甚至造成错误。

新鲜配制的染料偏碱,须在室温或是37℃下贮存一定时间,待染料成熟,主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用,贮存时愈久,染色效果愈好。

EAMGILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。

RA测定方法如下:取瑞特染液15-25μl(视染液浓度而定),加甲醇10ml稀释,混匀后以甲醇为空折管,分别以波长650nm和25nm比色。

Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm,伊红吸收峰波长为525nm;天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。

所以新配染料RA接近2,随着美蓝逐渐氧化为天青B,RA也相应下降。

RA下降到1.3±0.1时即可使用。

瑞特染液贮存过程中,以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。

有人主张在配方中加入甘油30ml,防止甲醇挥发,为了细胞染色清晰。

甲醇必须纯净,如甲醇中丙酮含量过多,染色偏酸,使白细胞着色不良。

本法的特点是将固定和染色合并在一起进行,手续简便,染色时间短,对白细胞特异性颗粒着色较好,但对核的着色略差。

2.姬姆萨(Giemsa)染色法姬姆萨染料由天青和酸性染料伊红组成的复合染料。

染色原理、缓冲液与瑞特染色法大致相同。

本法对细胞核结构和寄生虫着色较好,结构显示更为清晰,但细胞质和颗粒着色较差。

3.瑞-姬染色法
瑞特染色液和姬姆萨染色液对细胞进行染色时有各自的显色特征,前者对细胞浆和颗粒着色较好,后者对对细胞核结构显示清晰。

因此将瑞特染料和姬姆萨染料混合,甲醇溶解后组成瑞-姬染色液能取长补短,优势互补,其中所使用的缓冲液与瑞特染色法相同。

用该混合染液对血细胞进行染色,细胞核、细胞浆和细胞内颗粒着色均有上佳表现,着色鲜艳,对比鲜明,是临床上广泛使用的方法。

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