分离大小相同密度不同的物质；介质常用铯Байду номын сангаас；铯盐对铝有腐蚀，防止溅出；不会有共沉
沉淀分离
盐析法
原理：盐的存在减弱了蛋白分子周围的水化膜，导致蛋白发生聚集而沉降
有机溶剂沉淀
优：分辨率高、溶剂易除；缺：有毒、可能会是蛋白失活
非离子聚合物沉淀
常用聚乙二醇
离子交换层析
凝胶层析
常用凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、Superdex
利用生物发光物质标记Ag或Ab
微粒子化学发光免疫分析
顺磁性微粒子为载体、用ALP标记；以AMPPD作为发光剂
电化学发光免疫分析
三联吡啶钌是电化学发光免疫分析用的发光剂；检测广泛；持续时间长；信号强；灵敏度高等
第三部分：具体物质的检测
免疫细胞的检测
细胞分离法
外周血WBC的分离
自然沉降法和高分子聚合物沉降法
抗体的制备
多克隆抗体制备
使用免疫原免疫动物获得抗体、又叫抗血清；
弗氏完全佐剂（CFA，石蜡油+羊毛脂+卡介苗）和弗氏不完全佐剂（IFA，石蜡油+羊毛脂）
大致过程：获取、鉴定、纯化、保存
单克隆抗体（McAb）制备
原理：杂交瘤技术等
亲本细胞的选择与融合：无菌取脾
HAT培养基的选择作用
阳性克隆选择与克隆化
血清学分型
微量淋巴细胞毒试验：原理、阳阴性
细胞学分型
双向混合淋巴细胞培养；单向混合淋巴细胞培养
基因分型
限制性片段长度多态性-聚合酶链反应PCR-RFLP
特异性寡核苷酸探针-聚合酶链反应PCR-SSOP
序列特异性引物-聚合酶链反应PCR-SSP
单链构象特异性-聚合酶链反应PCR-SSCP
基于基因测序的HLA分型ＳＢＴ
第一部分：基本理论
抗原抗体反应
抗原
抗原的两种特性：免疫原性、免疫反应性
共同抗原、交叉反应、异嗜性抗原、超抗原等
抗原的分类依据性能：完全抗原、不完全抗原
依据抗体产生是否要T cell刺激：胸腺依赖性抗原（TD-Ag）、胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）
丝裂原
刀豆蛋白A（ConA）
T细胞有丝分裂原
植物凝集素
亲和层析
利用欲分离物质和它们的特异性配体间具有特异性亲和力
电泳
有支持体
纸电泳
醋酸纤维薄膜
薄层电泳（薄膜或薄板）
非凝胶性支持体区带电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶等）
凝胶支持体区带电泳（淀粉液、聚丙烯酰胺凝胶）
无支持体
Tiselius移界电泳
显微电泳
等点聚焦电泳
等速电泳
密度梯度电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳区别
荧光标记抗原(抗体)直接检测抗体(抗原)
间接染色法
酶联免疫+荧光标记
补体结合免疫荧光
Ag,Ab结合激活补体；荧光素标记抗补体的抗体；
双标记染色
标记不同抗体检测同一样品
流式荧光免疫技术
定量分析或纯化；流式细胞仪与荧光免疫结合
6.放射免疫技术(R)
*精确测定各种微量物质
放射免疫分析(RIA)
原理：标记抗原(可以为半抗原)Ab*和非标记抗原Ab对特异性抗体Ag(一定量)的竞争结合反应
橘红色粉末；激发后为橘红色荧光
四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
紫红色粉末，激发后有橙红色荧光；猝灭速度慢
藻蛋白类
藻红蛋白PE(此类最常用)、藻青蛋白PC、别藻青蛋白APC；多呈现橙色或红色物质
荧光显微技术
光源
短波光；波长连续或不连续；
滤板
隔热滤板、激发滤板、吸收滤板；
光路
透射光或落射光
分类
直接染色法
免疫电泳
对流免疫CIEP
双扩+电泳；Ag向正极泳动、Ab向负极泳动
火箭电泳
单扩+电泳；定量
免疫电泳
先蛋白区带电泳、再双扩
免疫浊度测定（定量）
透射浊度测定、散射浊度测定
免疫速率抑制浊度测定
用一定量的已知半抗原-载体与限量特异性抗体反应，测定生成的半抗原-载体-抗体所造成的散色速率
2.凝集反应
①颗粒性抗原或带有可溶性抗原的载体
第二部分：免疫检验技术
1.沉淀反应
①可溶性抗原；②多克隆抗体更适合；③R型血清首选
液相沉淀试验
环状沉淀试验：定性
絮状沉淀试验
抗体稀释法、棋盘格法（找出Ag、Ab最佳比例）
凝胶沉淀试验
单向扩散试验
定量试验；两个曲线
双向免疫扩散试验(定性)
沉淀线数目：抗原或抗体不纯；沉淀线弯向分子量大的；沉淀线靠近浓度低的；可以测定效价(半定量)
不直接参与化学发光反应；三联吡啶钌
具体技术
化学发光免疫分析(CLIA)
以化学发光物质(如吖啶酯)直接标记Ag或Ab，发生免疫反应后，直接引发化学发光进行检测
化学发光酶免疫技术(CLEIA)
采用催化某一发光反应的酶标记Ag或Ab，形成酶标记抗原-抗体化合物；加入了催化发光的酶，使发光速度加快
生物发光免疫分析(BLIA)
制备单克隆抗体：在小鼠腹腔诱生出肿瘤并产生含McAb的腹水
鉴定、保存、应用
基因工程抗体的制备
抗原抗体的纯化
离心分离
差速离心
粗分离；会有共沉；分离分子量相差大的物质；动力学方法
密度梯度离心
用于分离密度相近大小不同；常用介质为蔗糖、甘油；离心分离的物质密度一定要大于密度梯度介质的最大密度；有共沉
等密度梯度
化学发光
常温下，伴随化学反应过程所产生的光的发射现象
发光标记物
直接参与发光反应的标记物
标记物本身就是化学发光中的能量转移载体，发光底物；如鲁米诺类、吖啶酯类、苯酚类
以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物
即作催化剂，又参与化学发光反应
HRP对鲁米诺和H2O2起催化作用
ALP
以能量传递参与氧化反应的非酶标记物
自身红细胞凝集试验
主要试剂为抗人O型红细胞MCAb，可以与各型RBC结合却不引起凝集；样本为全血
特点是排除由于红细胞凝集可能引起的假阳性
3.补体试验
系统：①缓冲液PBS②补体③SRBC④溶血素
补体测定试验
血清总补体活性(CH50)测定
活化经典途径；为么要50%溶血作为终点测定；意义
旁路活化途径(AP-H50)测定
双位点一步法
双抗夹心时，待测样品和酶标物一起加入
间接法
检测抗体最常用
竞争法
既可测抗原，又可测抗体；参考管和待测管对照观察
5.荧光免疫技术(F)
*阳性细胞数量和荧光强度可以作为定量或半定量指标
常用荧光物质
异硫氰酸荧光素(FITC)
最常用、最广泛；黄色或橙黄色粉末；激发后发出黄绿色
四乙基罗丹明(RB200)
Ⅲ型
①抗原抗体(IgM、IgG或IgA)形成免疫复合物IC并沉积于全身多处②实验性局部过敏；人类局部ICD；血清病；急性免疫复合物性肾小球；系统性红斑狼疮；类风湿性关节炎
Ⅳ型
①由T细胞与抗原作用后，引起单个核细胞侵润；迟发型，属于细胞免疫应答②传染性迟发型超敏反应(结核病、病毒和某些真菌感染)；接触性皮炎
外周血单个核细胞分离
密度梯度离心法；
淋巴细胞分离
玻璃器皿吸附；媳妇过滤；磁铁吸引
淋巴细胞亚群的分离纯化
E玫瑰花结分离：T细胞能结合SRBC结合
尼龙分离：T细胞表面绒毛短少，B则多长、易吸附在在尼龙毛上
亲和板结合法：单抗与不同亚群的淋巴细胞结合在板上不易被洗掉
流式细胞仪分选法
磁性激活细胞分离器分离法：用于T细胞亚群分离
T细胞有丝分裂原
美洲商陆丝裂原
T细胞和B细胞有丝分裂原
脂多糖（LPS）
B细胞有丝分裂原
葡萄球菌A蛋白（SPA）
B细胞有丝分裂原
抗体
结构与功能：略
IgG
单体分子、血清和细胞外液中含量最高
IgM
五聚体、分子量最大、不能透过胎盘、宫内感染指标
IgA
有两种类型（血清型和分泌型）、对新生儿早期抗感染十分重要
IgD
单体分子、膜结合型IgD是Bcell分化成熟的标志
IgE
单体分子、含量最少、特异性过敏和寄生虫感染中有意义
抗原抗体反应原理
结合力、亲和力与亲合力
抗原抗体反应特点
①特异性；②比例问题：等价带、前带、后带；③可逆性
影响因素
反应物
抗原
理化性质、抗原表位等
抗体
来源：R型血清和H型血清
特异性与亲和力
反应条件
电解质、酸碱度、温度、比例
细胞因子抗病毒活性的检测方法
趋化活性得到测定
免疫学测定
ELISA
双抗体夹心法
竞争法
Western印迹
单个细胞分泌细胞因子的测定
反向反向溶血空斑实验RHPA
酶联免疫斑点试验ELISPOT
细胞内细胞因子的测定
分子生物学方法
Southern印迹
Northern印迹
RT-PCR
基因芯片
人类白细胞抗原分型检测技术
基因芯片
超敏反应及其检验
超敏类型
Ⅰ型
①发作快、消退快；有明显的个体和遗传倾向；不引起严重的组织细胞损伤；主要由于IgE的产生和介导②过敏性休克、呼吸道过敏、消化道过敏、皮肤过敏
Ⅱ型
①细胞溶解型或细胞毒型；有IgG和IgM等其他介导，然后再补体和吞噬细胞的作用下引起细胞溶解或组织损伤②输血反应；新生儿溶血反应；自身免疫溶血性贫血；肺-肾炎综合征；药物过敏引起的血细胞减少；甲状腺功能亢进
计数仪
γ射(131I,125I)线用晶体闪烁计数仪