蛋白质纯化一．可溶性蛋白的纯化1. 盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

这种方法称之为盐析。

盐浓度通常用饱和度来表示。

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。

2. 亲和纯化2.1. Ni柱纯化2.1.1．Ni柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min)；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（≥6 sec/drop）。

2. 上清与填料混合后，低速离心（≤ 500 x g），吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。

也可以直接上柱。

3. 上样后先用5-10 柱体积（CV）的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。

在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10，20，30，40，50 mM），然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。

4. 清洗结束后，用高浓度咪唑（如200 mM）洗脱目的蛋白质。

5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffer。

6. 一般情况下his tag不需要切除。

当需要切除时：的蛋白质最少1）TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。

100 OD280的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃的三倍）。

可用1 OD2802) Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。

在1 x PBS中，10 U/mg蛋白质，4或20℃酶切过夜。

可适当加大酶量或延长酶切时间。

2.1.2．Ni柱纯化注意事项1．新的Ni柱填料存放于20%乙醇中（体积约为1:1）。

在取用前，请先估算目的蛋白质的量，再决定取用的填料体积（Qiagen的Ni-NTA Superflow最大结合能力为30 mg protein/ml beads）。

填料用量不要大大超过所需量，不然会结合较多的杂蛋白，难以清洗干净。

O冲洗，除去乙醇。

再2．新填料使用前，要先进行处理和平衡。

填料先用ddH2用至少5 CV的buffer进行平衡。

3. 在使用前后，要注意不能让填料放干，不然会影响纯化的效果。

O清洗，3. 每次使用结束后，填料用高浓度咪唑（如500 mM）清洗，再用ddH2最后保存在20%乙醇中。

4. 不推荐Ni柱在柱酶切，这样效率很低。

5. 多次使用后填料需再生。

再生步骤为：5 CV HO→ 3 CV 2% SDS→ 1 CV225% EtOH→ 1CV50% EtOH→ 1 CV75% EtOH→ 5 CV100% EtOH→1 CVO→ 5 CV 100 75% EtOH→ 1CV 50% EtOH→ 1 CV 25% EtOH→ 1 CV H2mM EDTA，pH8.0 →H2O→ 2 CV100 mM NiSO4→ 2 CV H2O→20% EtOH。

2.1.3. Q & A1. 目的蛋白质挂柱能力差？可能是由于所用buffer中含有过多的detergent或还原剂如 -ME等。

Ni柱填料和试剂兼容性请查阅手册。

还可能是由于蛋白质折叠不正常，或折叠时将his tag 包裹在内所致。

可以采用的方法是：1）控制破菌条件，不可以过于剧烈；2）改变buffer条件，可能有利于蛋白质折叠稳定；3）将his tag构建到蛋白质另一端。

2. 杂蛋白很多，无法清洗干净？解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行清洗；在破菌或结合时加入少量咪唑（如10 mM）；减少填料使用量。

3. 蛋白质洗脱不下来？解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行洗脱；更换buffer。

4. 蛋白质发生降解？更换蛋白质抑制剂，或多种抑制剂混合使用；截取其它truncates。

2.2. GST柱纯化2.2.1．GST柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与GST填料在4℃下进行充分旋转混合，或可以让上清液缓慢流经GST柱（≥6 sec/drop）；2. 在充分混合后，将混有填料的上清load上柱子；3. 用大量的lysis buffer（1 x PBS）清洗GST柱，至没有杂蛋白流出（用bradford 检测）；4. 新鲜配制洗脱液：50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0。

将5-10CV的洗脱液加到柱子上，静置一段时间（如10 min），再缓慢流出（≥6 sec/drop）。

5. 洗脱后酶切：洗脱后的GST融合蛋白质溶液先透析除去reduced glutathione，然后加入PreScission或Thrombin进行酶切。

6. 在柱酶切：在洗脱之前，吸取beads，500 x g离心5 min，弃上清。

然后加入酶液，进行酶切。

PreScission：酶切buffer：50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5。

10 U/mg protein，5℃酶切4 hr。

可适当加大酶量或延长酶切时间。

Thrombin：在1 x PBS中，10 U/mg protein，4或20 ℃酶切过夜。

酶切结束后，用3-5 CV的1 x PBS冲洗柱子，收集目的蛋白质。

最后用洗脱液清洗beads上残余的GST和GST融合蛋白。

2.2.2．GST柱纯化注意事项1.GE的Glutathion Sepharose 4B Fast Flow最大结合能力为10 mg protein/ml beads。

2. GST填料使用前用至少5 CV的buffer平衡，buffer的pH范围为：6.5—8.0。

3. GST填料机械强度较差，所以在混合时要注意控制力度和时间。

O 4. 洗脱后，GST填料可用6 M盐酸胍或8 M尿素清洗，再生。

然后用ddH2清洗后浸泡在20%乙醇中。

2.2.3．Q & A1. 目的蛋白质挂柱能力差？解决方案有：1）保证充分混匀；2）检测蛋白质溶液的pH值是否在合适范围内；3）检查蛋白质溶液是否加入过多的DTT（> 1 mM）。

2. 目的蛋白质无法洗脱？提高reduced glutathione浓度，但注意不要改变pH值；延长洗脱时间，并不定期吹打；在洗脱液中加入一些非离子型detergents如0.1% Triton X-100。

3. GST切不下来？一般情况下，洗脱后酶切比在柱酶切效率高，所以选择洗脱后酶切；可以提高酶的用量，升高酶切温度，延长酶切时间；更换相应载体，用另一种酶进行酶切。

2.3. IgG纯化纯化操作流程如下：2.3.1．制备单克隆抗体1. 购来F1代小鼠，或Bab/c小鼠，饲养一周；2. 腹腔注射Plaston 200 ul/只，饲养10天；3. 将特定细胞注入腹腔；4. 一周起观察小鼠腹水的产生的情况，随时采集腹水。

2.3.2．硫酸铵沉淀1. 取来的腹水用生理盐水以1:1比例稀释；2. 稀释后腹水用滤纸过滤，去除脂蛋白及杂质，得到澄清的上清溶液；3. 在上清中缓慢地边搅拌边加入等体积硫酸铵饱和溶液（4 ℃下操作）；4. 随硫酸铵加入量的增加，溶液逐渐变混浊，加完后再搅拌10 min左右，4 ℃过夜；5. 将放置过夜的悬浊液4 ℃，7000 rpm离心20 min，弃上清，得到乳白色沉淀；6. 用适量50%硫酸铵重悬沉淀，重复以上操作一次，沉淀-30 ℃保存备用。

2.3.3．亲和层析1. 将经20mM PBS，pH7.4透析过夜的腹水与ProteinA 混合过夜；2. 将混合过夜的样品上柱，收集流出液；3. 用20mM PBS，pH7.4 buffer洗柱子，约10个柱体积；4. 用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱，洗脱前预先在每个EP管中加入50 ul中和溶液（2M Tris)。

5. OD280读数；6. 亲和力好的，将流出液与ProteinA重新混合，4 ℃过夜，准备第二次、第三次纯化；亲和力不理想的，将流出液再与ProteinG 混合，4 ℃过夜；7．电泳鉴定。

2.3.4．IgG的Fab片段的获得2.3.4.1．木瓜蛋白酶酶切方法1. 酶切体系如下：0.5 M EDTA 1 ul1 M cystine 100 ul10 mg/ml papain 6 ul酶切缓冲液1767 ul（0.1 M NaAc，1 mM EDTA，用醋酸调pH值至5.5）37 ℃激活10 min；2. 在上述酶切反应体系中加入16 mg/ml的mAb共126 ul，反应总体积为2 ml，将反应液于37 ℃酶切5 hrs；3. 封闭：避光加入92 mg/ml Iodoacetamide (IIA) （碘乙酰酶）326 ul ，避光反应40 min ；4. 透析：对20 mM Tris-HCl ，pH 8.9，更换2次。

2.3.4.2．阴离子交换柱（5 ml Q FF 柱）纯化Fab 片段 阴离子交接缓冲液：Buffer A ：20 mM Tris-HCl ，pH 8.9；Buffer B ：20 mM Tris-HCl ，pH 8.9，1 M Nacl (含0.02% NaN 3)。

以50 min 时间梯度达至100% buffer B ；约4分钟后开始出现蛋白峰，其中峰1为Fab ，如下图所示。

PEAK I PEAK II PEAK IIPEAK I3. 凝胶过滤3.1. 操作流程（配合AKTA操作）1. 在使用分子筛之前，请先确定目的蛋白质在过分子筛的buffer中是稳定的。

如果目的蛋白质所处的buffer和过分子筛的buffer有所不同时，请确定在溶液改变过程中目的蛋白质不会发生沉淀。

否则，不可以进行凝胶过滤操作。

2. 根据蛋白质的分子量大小、总量、总体积和实验目的，选择合适的分子筛进行实验。

24 ml分子筛价格较高且使用寿命较短，所以它仅用于定性分析或蛋白质提取困难且总量较少时的纯化，不可以用于大规模纯化。

3. 使用者用自己的账户登录，将分子筛分子筛连接到AKTA上，先后用新鲜配O和buffer平衡柱子（至少1.5 CV），至基线走平。

置并除气的ddH24. 蛋白质样品上样前必须高速离心13000 rpm x 10 min，取上清上样。

5. 在出峰时进行样品的收集。