β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用摘要：β-半乳糖苷酶是一种可以把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的酶。

低聚半乳糖是一种具有天然属性的功能性低聚糖，在食品及保健品中应用广泛。

因此，研究β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用具有极强的现实意义。

关键词：β-半乳糖苷酶；低聚乳糖；生产方法；工艺过程控制；固定化反应器；酶分离提取方法Abstract：β- galactose glucoside enzyme is a kind of enzyme that can put the lactose hydrolysis into galactose and glucose. Low poly galactose is a natural functional oligosaccharide which has been widely applied in food and health products. Hence, doing Research of β-galactose glucoside enzyme’ application in the low poly galactose production has strong practical significance.Key words：β- galactosidase； galacto-Oligosaccharides；method of production; process control; immobilized enzyme reactor; methods of Extraction and Isolationβ-半乳糖苷酶,简称乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。

β-半乳糖苷酶的最初应用也是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。

利用各种技术手段研究β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用具有一定现实意义[1]。

1.菌株选育1.1低聚半乳糖生产法低聚半乳糖(GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7 个半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n 为0-6)。

在自然界中，动物的乳汁中存在微量的GOS，而人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS 成分。

1.2发酵法中发酵工艺过程控制培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。

培养基的选择：（1）根据微生物的特点选择培养基（2）根据发酵方式选择培养基发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行发酵，并根据微生物对氧的需求，分别作静止或通风培养。

而固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌落特征鉴定、活细胞数测定等方面。

1.3从生产实践和科学试验的不同要求选择种子培养基要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应较高，所用原料也应是易于被微生物菌体吸收利用。

常用葡萄糖、硫酸铵、尿素、玉米浆、酵母膏、麦芽汁、米曲汁等作为原料配制培养基。

发酵培养基除需要维持微生物菌体的正常生长外，主要是要求合成预定的发酵产物，所以，发酵培养基碳源物质的含量往往要高于种子培养基。

当然，如果产物是含氮物质，应相应的增加氮源的供应量。

1.4从经济效益方面考虑选择生产原料以价廉、来源丰富、运输方便、就地取材以及没有毒性等为原则选择原料。

培养基的配制原则：（1）根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基（2）营养成分的恰当配比C/N培养基的组分 (包括这些组分的来源和加人方法)、配比、缓冲能力、黏度、消毒是否彻底、消毒后营养破坏的程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物形成有影响。

可考虑用“正交试验设计”等数学方法来确定培养基组分和浓度。

同时还要注意生理酸、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配[2]。

一般发酵工业中碳氮比约为100: (0.2-2.0)，但在氨基酸发酵中，因为产物中含有氮，所以碳氮比就相对高一些。

注意快速利用的碳 (氮)源和慢速利用的碳 (氮源)的相互配合，选用适当的碳氮比。

一般发酵工业中碳氮比约为100:(0·2-2·0)，但在氨基酸发酵中，因为产物中含有氮，所以碳氮比就相对高一些。

如谷氨酸发酵的C:N=100:(15-21)。

（3）渗透压在发酵生产过程中，通常趋向在较高浓度下进行发酵，以提高产物产量，并尽可能选择高渗透压的生产菌株。

(4) 物理、化学条件适宜各种微生物均有其生长繁殖的最适pH，细菌为7.0～8.0，放线菌为7.5～8.5，酵母为3.8～6.0，霉菌为4.0～5.8。

对于具体的微生物菌种，都有各自的特定的最适pH范围，有时会大大突破上述界限。

在微生物生长繁殖过程中，会产生能够引起培养基的pH改变的代谢产物，尤其是不少微生物有很强的产酸能力，如不适当地加以调节，就会抑制甚至于杀死其自身。

在设计培养基时，要考虑培养基的pH调节能力。

一般应加入缓冲液或CaCO3，使培养基的pH稳定。

2.固定化酶的应用酶是高效、专一性强的生物催化剂。

生物体内的各种化学反应都是在酶催化下进行的，但是自由酶在水溶液中很不稳定，可溶性酶一般只能一次性地起催化作用，同时，酶是蛋白质对热、高离子浓度、强酸、强碱及部分有机溶剂等均不够稳定，容易失活而降低其催化能力，这些不足大大限制了酶促反应的广泛应用。

固定化酶技术克服了自由酶的上述不足，并且酶可以回收及重复使用，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一。

酶的固定化方法可大致分为吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4 种[3]。

2.1吸附法吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，根据吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。

该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。

2.2共价偶联法共价偶联法是将酶的活性非必须侧链基团与载体的功能基通过共价键结合，故表现出良好的稳定性，有利于酶的连续使用，是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价偶联反应容易使酶变性而失活。

2.3交联法交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，其更易使酶失活。

2.4包埋法包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应，故可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质和用于柱反应系统，且常有扩散限制等问题。

3.酶分离提取的方法酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂[4]。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。

下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍：3.1预处理及固液分离技术3.1.1细胞破碎（cell disruption）高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。

将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。

菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。

细胞破碎率与细胞的种类有关。

要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。

最好是提高操作压力，减少操作次数。

但有人报道，当操作压力达到175Mpa时，破碎率可达100%。

当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上升较为缓慢。

高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。

丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。

在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。

容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。

具体做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%（体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。

3.1.2离心离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。

过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。

沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。

分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。

在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物生产的技术要求，这包括灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。

现代哦离心机装置包括以下三个步骤，并进行程序控制：离心、离心系统的灭菌及就地清洗。

如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具有双重轴向密封，密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防止产品被污染，也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。

该离心机又如一个密闭的压力容器，可在121℃温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能有效地控制温度，这对于生物制品是非常重要的。

如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。

该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。

3.1.3膜分离技术在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。

在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜，使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜表面。

大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。

功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。

超滤浓缩的优点是：操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。

超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤器，水及低分子量物质排出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。

当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。

超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题：第一，在超滤循环过程中，由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。

因此，料液贮罐应加冷却系统，并安装自动测温及控制系统。

第二，某些酶的辅助因子散失为问题：一些酶含有辅助因子，其分子量小，超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。