郭秒,食品与工业发酵，2004
类胡萝卜素的作用：色素、营养保健
原培养基:
▪2、 通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例) 考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源
进一步：确定成分的合适浓度。
• 据图可以看出，0．2％的乙酸钠浓度下
菌株生长得最好，而过量的乙酸钠浓度反而 会抑制混合菌株的生长。
某些营养物质调节培养基的pH，但更应在配 制培养基时考虑所用营养物质的组成成分，注 意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况.
• ② 控制pH最常用的方法是在培养基中添加具
有一定缓冲能力的物质作为营养物，如以磷酸 盐作为磷的成分；或者避免使用容易产生生理 酸性或碱性使培养基pH波动太大的物质
四、正交试验在培养基确定中的应用 培养基设计的步骤
• 微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的 酶．将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂 肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细 胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现 的。
• 所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和 产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机 元素、生长因子及水、能源或氧气等。对于大 规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外， 还必须重视培养基原料的价格和来源。
所以选择合适的无机氮源有两层意义：
满足菌体生长
稳定和调节发酵过程中的pH
2、有机氮源
来源：实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等作为有机氮 源，工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼 粉、麸皮等原料作氮源。
成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。
例 玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等
• 3.合适的C、N比
一般为100∶0.2～2.0
• 4．控制合适的pH • 在最适pH值下有利于加快各种酶的反应。
pH的具体控制方法
①可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流
加某些营养物质调节培养基的pH，但更应在 配制培养基时考虑所用营养物质的组成成 分，。
pH的具体控制方法
• ①可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加
(NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4
NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸 性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸 性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢 后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如 硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程 的pH有积极作用。
① 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑 的问题，初步确定可能的培养基成分；
② 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；
③ 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。
1、查阅资料，确定可能的培养基成分。
类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化
• 作用：使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。 培养出强壮、健康、活性高的细胞。
三、发酵培养基成分选择的原则
• 1．快速利用碳（氮源）和缓慢利用碳（氮源） 应当混合使用。
• 2．配制合适的浓度
• 氮源过多，菌体繁殖旺盛，形成高不利于产物的积累， 不足，菌体过少，同样不利于产物的积累；
• 碳源过多，形成低，不足，菌体衰老和自溶。
对于酿造行业，水的重要性不言而喻
对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的 水。
二、发酵生产中的培养基类型
• 工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用 分为：
• 斜面培养基 • 种子培养基 • 发酵培养基 • 摇瓶培养基
1．斜面培养基
• 作用：这是供微生物细胞生长繁殖、保存用的培 养基。
结果： 碳源：乙酸钠 0. 2% 氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏0.03%
无机盐: 复合无机盐0.05%
▪3、 多因子实验：根据单因素实验的结果，设计了3水平4因 ▪方差分析表，如表12，实验结果表13。
Ki:表示任一列上水平号为i(本例中i=1,2或3)时所对应的实验结果之 和。例如，表中在B因素所在的第3列上，第1、4、7号实验中B取 B1水平，所以K1为第1、4、7号实验结果之和。
用原发酵培养基
改进后培养基 原培养基
改进后培养基的发酵结果
五、发酵培养基优化的层次 摇瓶水平到反应器水平 摇瓶、反应器培养基研究的两个层次
摇瓶——培养基设计的第一步
反应器—最终的优化的基础配方
例：青霉素发酵
发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO4 0.8% 轻质碳酸钙1%
发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8% 补加硫酸、前体等
氮源使用的一些相关问题：
有机氮源和无机氮源应当混合使用 早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质
有些产物会受氮源的诱导和子、前体和产物促进剂
▪生长因子
从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机 物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
▪ 产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又
非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
（6）水
对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在 不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。
水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶 性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。
• 特点： • 1.富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有
利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。 • 2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源
和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少 形成孢子。 • 3.斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要 的生长因子和微量元素。
2．种子培养基(包括摇瓶种子和小罐 种子培养基)：
与微生物有关的维生素主要是B族维生素，这些维生 素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活 动。
营养缺陷型菌株的培养通常要加入生长因子。
有机氮源是生长因子的重要来源，多数有机氮源含有 较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少 的生长因子。
▪ 前体
前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生 物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结 构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大 的提高。
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有转化 率的问题
例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml 苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%
用法：
前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生 长不利，为了避免前体浓度过大，前体使用时 普遍采用流加的方法，流加也有利于提高前体 的转化率。
第三章 培养基
• 第一节 工业发酵培养基
• 第二节 正交试验在发酵培养基确定中的 应用
• 第三节 淀粉水解糖及糖蜜原料的制备
第一节 培养基的选择和确定
• 一、培养基的营养成分与作用 • 二、培养基的用途 • 三、发酵培养基的设计 • 四、培养基确定方法 • 五、正交试验在培养基确定中的应用
第一节 工业发酵培养基
3、利用原则 快速利用氮源和缓慢利用氮源应当混合使用
• （3）氮源
氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、 核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机 氮源和无机氮源。
1、无机氮源 种类：尿素，氨盐，氨水，硝酸盐等无机氮
特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利 用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变 化如：
一、工业发酵培养基的营养成分
• （1）能源 • 自养菌：光；氢，硫胺；亚硝酸盐，亚
铁盐。 • 异养菌：碳水化合物等有机物，石油
天然气和石油化工产品，如醋酸。
• （2）碳源：
1、作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需 的碳成分
提供合成目的产物所必须的碳成分
2、来源 淀粉水解糖，糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、石蜡，天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品
• 因素A和因素C对实验结果影响特别显著。对因素A，最大 数是K1。对因素C，最大数是K3，因此选择A1C3。对于 因素B和D选择最大数K2和K1 ，因此最佳培养基为： A1B2C3D1。即最佳培养基：
• NH4C1 2 g，乙酸钠2 g、KH2PO4 0．12g、MgSO4. 7H2O 0．01g、Na2CO3 0．1g，酵母膏0．5g，复合无机盐溶液 0．5 mL，水1000 mL，pH 7．0
摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大
摇瓶优化配方：反应器研究的基础
发酵罐：反应器水平, 可以得出最 终优化的基 础配方