液相色谱常见问题分析
解决色谱问题的策略
规则一规则一∶∶确认问题至少发生两次以上确认问题至少发生两次以上。
如果问题不重复出现如果问题不重复出现，，很
难证实其确实是问题
规则二规则二∶∶从最简单的因素入手
规则三规则三∶∶一次只变化一个因素一次只变化一个因素，，以使你能够确认所变因素与问题
之间的关联
规则四规则四∶∶恢复原状恢复原状。
如果使用更换组件方法来查找问题之所在如果使用更换组件方法来查找问题之所在,,完
毕后应将原有完好组件安装回原处毕后应将原有完好组件安装回原处。
规则五规则五∶∶养成记录的好习惯养成记录的好习惯。
一个完整的好记录是成功地进行故
障排除的关键
HPLC系统压力问题–压力高
–压力低或没有压力–压力不稳
流路基线噪音问题–基线不稳定
–长、短程振荡
–基线漂移
–噪音脉冲尖刺
什么是反压(Back Pressure)
–流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压, 又称系统压力–Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋)
–其它单位有:Bar,Mpa(1Bar=0.1Mpa=14.5Psi)
影响系统反压的主要因素:
–流动相的溶剂组成
–温度
–流速
流动相的粘度是产生反压的主要原因,粘度越大,反压越高 流速对反压的影响是线性关系,流速越大,反压越高
温度对反压的影响是反比关系,温度升高,反压降低
反压与色谱柱长度成正比
反压与填料颗粒度的平方成反比
–3.5µm填料比5µm填料反压高
反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)
反压与管路的长度成正比
问题:系统压力高
可能的原因:
—温度太低
—流速太高
—流动相粘度大
管路堵塞
—管路堵塞
—仪器或色谱柱堵塞
—压力传感器问题
问题:压力低或没有压力
可能原因:
—温度太高;流速太低
—泵关闭或保险丝断了
—泵未输送流动相
系统内有渗漏处
—系统内有渗漏处
—所用溶剂不正确
—自动进样器在Purge时卡住
问题:压力不稳
可能原因:
—压力传感器问题
—泵排气不充分
—泵失效
流动相未正确脱气
—流动相未正确脱气
—所用溶剂不混溶或易挥发
基线不稳定
o检测池中有大的气泡
o流路中有小气泡流过
o系统未稳定或未达到化学平衡
o流动相被污染
检测器流动池漏
o
o色谱柱污染
无规律基线噪音
有规律的基线噪音
基线漂移
o系统不稳或未化学平衡
o温度波动
o流动相未正确脱气
o流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化检测器流动池漏
o;系统中有渗漏
o色谱柱污染;固定相渗漏
o选用不正确的检测波长(相对于溶剂)
o有迟流出的组分
色谱图常见问题主要有三类:
–色谱峰峰形异常问题
o例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等–色谱图中多峰少峰问题
o色谱图未出峰,出峰比预想的多等
–色谱峰保留时间问题
o保留时间不稳定等
色谱柱毁坏
溶解样品的溶剂不当 第二种相互作用
色谱柱过载
–质量过载
–体积过载
其它柱外效应
–管路连接
–采样速率
–时间常数
填料平齐
填装良好的色谱柱
表明:系统
色谱柱、、连接状况皆良好系统、、色谱柱
填装良好的色谱柱
填料塌陷
所有的峰都变形！
可能的原因:–振动使柱床破坏
–高pH 流动相使填料颗粒溶解
Voids -high back pressure, distorted and/or double peaks
当上样量超过一定限度时发生–注意峰起点提前进样6.25 µg
分析规模上样量(6µg)获得良好的色谱峰形Absorbance 2Minutes 46
Absorbance 进样25 mg
制备规模上样量(25 mg)产生质量过载的色谱峰形注意注意：：分析与制备之色谱峰的落点位于相同保留时间24Minutes 6
注意注意：：
色谱峰起点相同
进样体积对色谱峰形的影响
500 µL 300 µL
100 µL
10 µL
.009"
连接管线内径对系统谱带展宽的影响 过长的管线亦会造成较大的谱带展宽.020".040"样品谱带在管线内发生了扩散
色谱峰峰形异常问题:
–峰比预想的要小
o 样品粘度过大
o 进样器有问题或进样体积有误
o 检测器设置不正确检测器设置不正确,,定量环定量环((Loop)Loop)体积不正确体积不正确检测器输出未置零
o o 用了不正确的检测器输出信号
o 检测池被污染
o 检测器的灯可能有问题
色谱图中未出峰
o进样问题:未进样或样品分解
o流动相问题:泵未输液或流动相不正确
不正确,,或检测器有问题o检测器设置不正确
色谱图中出峰比预想的少
o样品分解
o色谱柱柱效丧失
o用错流动相
o梯度洗脱时平衡不足
色谱图中出峰比预想的多(鬼峰鬼峰))
o 样品分解或制样时导入了杂质
o 流动相被污染流动相被污染,,或用错流动相
o 流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化o 前次进样的后流出物(某些某些Rt Rt Rt值特值特大的组分)进样器被污染,o 进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏o 未充分平衡进样器Loop 管
o 保护柱脏,色谱柱被污染色谱柱被污染,,分辨率下降
等度色谱：额外的色谱峰-尖锐-污染物
样品瓶，，瓶垫等
样品，，样品瓶
污染物来源：：样品
•污染物来源
等度色谱-宽峰--来自以前的进样
保留时间飘忽不定(各次运行之间)
o 系统不稳定或未达化学平衡o 泵压力不稳泵压力不稳((泵头里有气泡泵头里有气泡))o 进样体积过大或样品浓度过大o 温度波动
流动相混合不均匀
o o 色谱柱被污染
保留时间增加或减少(各次运行之间) o系统不稳定或化学平衡不足
o泵流速变化
o温度变化
色谱柱污染,,柱效下降
o色谱柱污染
流动相被污染
o
o溶剂入口过滤器堵或管路堵塞
o系统渗漏
保留时间改变到一个新的恒定值
o 流动相不正确或其组成不正确
o 泵流速变化
o 实际输液的流速不正确实际输液的流速不正确((泵失灵或故障泵失灵或故障))
o 环境温度变化环境温度变化；；柱温不正确
色谱柱尺寸或类型不正确
o o 色谱柱被污染
o 流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化
o 输液系统的梯度滞后体积不正确
化学因素
中性物质：：无影响
–中性物质
增加，，保留降低
酸性物质：：pH增加
–酸性物质
增加，，保留增加
碱性物质：：pH增加
–碱性物质
–0.1 pH的变化会导致高达10%的保留时间变化(pH在pKa +/-1之内保留时间变化最大)。