1200
1000
800
中药材
600
中成药
400
提取物
200
0 2000年版 2005年版 2010年版
液相色谱原理
基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固 定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和） 的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
A
柱塞A前进
Single ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱiston Delivery
Combined Delivery
柱塞B后退
泵的工作方式( 四元梯度)
比例阀
1、由比例阀来控制流动相比例的变化 2、可以同时使用多种溶剂，最大四种
泵的工作方式( 二元梯度)
混合器
1、由两个独立的泵来控制溶剂比例 2、只能同时使用两种溶剂 3、若要增加溶剂选择，可加入溶剂选择阀 4、质谱检测器的最佳前端
柱温与分离 (不经过预热器)
VWD1 A, Wavelength=338 nm (C:\AGILENT...\氨基酸20141031\转化糖电解质20141030 2014-10-31 13-04-46\AA对照.D) mAU
8
6
1.863 - 天门冬氨酸 3.296 - 谷氨酸
6.088 - 丝氨酸 7.044 - 组氨酸
7.76.4507-3 -苏甘氨氨酸酸 8.595 - 精氨酸
9.153 - 丙氨酸 10.663 - 酪氨酸 12.128 - 胱氨酸 12.789 - 缬氨酸 13.171 - 蛋氨酸 1144..578196 -- 苯异丙亮氨氨酸酸 15.538 - 亮氨酸
15.872 - 赖氨酸
4
2
不经过预热器，则甘氨酸和苏氨酸、 苯丙氨酸和异亮氨酸不能够分离。
自动进样器：有自动可变体积或者固定定量环形式 固定定量环形式：若需要不同体积进样，需要手动 更换定量环。 柱温箱：精确控温，保证色谱重复性。
检测器：根据应用不同，多种检测器模块可选。UVVWD，UV-DAD，FLD，ELSD
液相色谱仪的一般运行过程(示意图)
1. 高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很 大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液 泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成，其中高压输液泵是核心 部件。 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压 力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常 用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操 作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机 械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
泵的类型
消除流量脉冲－串联柱塞
单向阀
P
脉冲阻尼器
减少了单向阀用量 需要阻尼器 压缩因子补偿
Agilent 1100 Series Pumps: Solvent Compressibility Compensation
Piston Displacement (祃)
0
System Pressure>0
20
10
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
min
液相色谱原理
选择性差异从哪里来？
R
O
Si
R1
R
品牌1 C18键合方式
OH
R
O
Si R1
R OH
R
O
Si
R1
R
R1
O Si
R1 CH3 Si CH3 CH3
R1
O Si
R1 CH3 Si CH3 CH3
R1
O Si
R1
PG
R
品牌3 C18键合方式
PG
mAU 400
300 延迟体积 ~ 700 μL 起始等度时间约2分钟
200
100
0
mAU 400
0.5
1
1.5
2
300
200
100
0
0.5
1
1.5
2
3.7 min
2.5
3
3.5
4
2.6 min
4.5
min
延迟体积 ~120 μL 起始等度时间约0.3分钟
2.5
3
3.5
4
4.5
min
2．进样系统
负责把液态样品引入液相色谱的流动相中 进样器必须耐受液体系统产生的高压 自动进样器是进样的自动装置 进样器类型：
8
液相色谱原理
同品牌，同型号的色谱柱获得一致的选择性
Eclipse XDB C18 - Xanthines黄嘌呤
5 µm
α 2，3= 1.13
1
3.5 µm
2
3
4
α 2，3= 1.13
5
min
1
1.8 µm
2
3
4
α 2，3= 1.14
1
2
3
4
5
min
5
min
Eclipse XDB C18 – Barbitals巴比妥
水相/缓冲盐 对离子
离子
体积排阻色谱 聚苯乙烯硅胶等
(Size Exclusion)
水相（SEC/GFC） 大分子量化合物 有机相（GPC） 聚合物
液相色谱原理
色谱柱的选择
根据化合物的性质：极性、酸碱 性、电离能力选择色谱柱及流动 相。
一般情况下，遵循相似相溶原 理。
要注意相同类型色谱柱选择性的 差异。
： 关键点 流动相 固定相 相互作用
液相色谱原理
分离度公式
塔板数
选择性因子
容量因子
������
������ − 1
������′
������������ = 4 × ������ × ������′ + 1
Rs：分离度；一般要求大于1.5。分离度越大越好。 N：理论塔板数；与色谱柱填料粒度、长度、均一性等相关；理论板数越高越好。 α：选择性因子；与色谱柱键合相、硅胶封端技术等相关；选择性因子越大越好。 k：容量因子；与化合物性质、流动相、键合相相关；容量因子在0-10范围内影响大。
根据选定的模式进行色谱柱的选 择。
常见的高效液相色谱的分离模式
色谱类型 (Mode)
固定相 (Stationary Phase)
流动相 (Mobile Phase)
主要适用范围
(Compound Separated)
正相色谱 (Normal-Phase)
硅胶，氨基、氰基、二 醇基键合硅胶……
有机溶剂
固定定量环形式：一般用于手动进样器，需要手动更换 定量环以适用不同进样体积的需求
流通式：一般用于自动进样器，可进样最大loop环体积 内的任意量。流通式的交叉污染也较小。
手动进样器
定量环
自动进样器
3．温度控制系统
柱温的精确控制对于提高色谱柱的柱效，改善 色谱峰的分离度，缩短保留时间，降低反压， 保证分析样品结果的重复性，具有不可忽视的 作用。同时升高温度可以缩短保留时间，使实 验耗时少，减少流动相的消耗。因此，一个色 谱系统需要正确控制色谱柱柱温，所以柱温箱 已成为HPLC系统中的重要配套装置。
0.0040
0.0035 0.0030 0.0025 0.0020 0.0015
最佳流速范围
2.
5.0 m
3.
3.5 m
0.0010 0.0005
1.8 m
0.0000 -0.0005
0.4mL/min
2 mL/min
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Interstitial linear velocity (ue- cm/sec)
System Pressure=0
100
One Piston Cycle
TIME
w/o compensation with compensation
For internal use only 11
泵的类型
消除流量脉冲－并联柱塞泵
P 单向阀
A
B
相消干扰 通常也需要阻尼器 增加了单向阀的使用数量
B P
柱温箱
柱温箱的温度控制方式：
单加热：加热块 强制风冷 或者半导体（帕尔贴）制冷
帕尔贴元件是由一排排N和P型的半导体构成，通过在半导体里面转移电荷载体(如 N型中的电子和P型中的空穴)， 从而把热从一侧转移到另外一侧。再通过改变施 加电压的极性，元件可以被用来加热或冷却溶剂，样品和色谱柱。柱温箱模块中 的风扇用于把帕尔贴元件后部产生的热量带走。
0
-2
2
4
6
8
10
12
14
16 min
流动相不经过预热，甘氨酸/苏氨酸、苯丙氨酸/异亮氨酸分离度达不到要求
柱温与分离(经过预热器)
VWD1 A, Wavelength=338 nm (C:\AGILENT...\氨基酸20141031\转化糖电解质20141030 2014-10-31 14-26-47\AA对照.D) mAU
R
PG
R
CH3
O
Si
CH3
CH3
O
Si CH3
CH3