肉眼观察EB染色的DNA
要经过处理才能丢弃。
B：新型低毒染料： • 如Gold View、SYBR GreenⅠ、 SYBR Gold等。 • 毒性较低，但价格较昂贵。 • 灵敏度较好，但不如EB。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
4.琼脂糖胶液制备（1%，50 ml）
4.1 称取0.5 g琼脂糖，置于250 ml锥形瓶中，加入
——重新沉淀
DNA中残留有金属离子
——重新70%乙醇漂洗
基因组DNA提取常见问题分析
DNA降解
– 材料不新鲜或反复冻融 – 未很好抑制内源核酸酶的活性 – 提取过程操作过于剧烈，DNA被机 械打断 – 外源核酸酶污染
基因组DNA提取常见问题分析
DNA提取量少
实验材料不佳或量少 —— 选取新鲜（幼嫩）材料
60 ml 1×TAE电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂糖溶 解。一般需反复煮沸3次，琼脂糖才能充分溶解。加热过 程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。 加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发；
4.2
待胶液冷却至60℃左右时，加入5%的Gold View
染料，混匀，既成琼脂糖胶液。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
学 习 汇 报
核酸提取的原理及方法
汇报人:富贵 青海大学2010级研究生
前言
• 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象， 因此，核酸的提取是分子生物学实验技术 中 最 重 要 、 最 基 本 的 操 作 。
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取
1.实验器材
台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。
2.实验耗材
无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格Tip、一次性手套等。
3.实验试剂
质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO) 、LB培养基、抗生素、 琼脂糖、DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、 TAE电泳缓冲液等。
• 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行 的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞 中只有一份或几份拷贝；
• 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进
行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物
处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。
如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素 处理才能达到更高拷贝数。
离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理
离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的 SDS-碱裂 解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液
将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的洗
脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
质粒DNA提取及检测——实验准备
——减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。
解决办法:重新抽提一次，再沉淀、溶解。
RNA提取常见问题分析
电泳带型异常
上样量超过 3μg 电压超过 8V/cm 电泳缓冲液陈旧
均可能导致 28S 和 18S 条带分不开
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取
四．真核细胞总RNA提取
五．琼脂糖凝胶电泳
DNA的琼脂糖凝胶电泳
1 原理： DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带 负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖 凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子 形状的核酸，其移动速度有差异。因此， 利用这种“电荷”和“分子筛”的双重效 应，达到分离核酸的目的。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
2. 琼脂糖凝胶分离DNA的范围
Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 使酚容易去除。
该复合物在高盐溶液中（>0.7 mol/L NaCl）是可 溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚 类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度 Tris-HCl （pH 8.0） 100 mM EDTA （pH 8.0） 20 mM NaCl 0.4 M CTAB 2% (W/V) β-巯基乙醇 0.1%（V/V） 使用前加入
基因组DNA提取——CTAB法
• CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 终浓度
Tris-HCl EDTA NaCl （pH 8.0） （pH 8.0）
100 mM 20 mM
CTAB
PVP40
β-巯基乙醇 2%（V/V） 使用前加入
0.4 M 3% (W/V) 5% (W/V)
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种 不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同 时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
TRIzol试剂
TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫 氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白 质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽
提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后
可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋 白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为 DNA和蛋白质。
7.电泳
加完样后立即接通电源。控制电压小于8
V/cm，电流在100 mA以上。当溴酚蓝条带移动
到凝胶2/3时，停止电泳。
8.成像
在紫外透射仪或凝胶成像系统上观察电泳结果。 保存图像。
倒胶温度不要太低； 先赶气泡、再插梳子。
胶液60℃ 加染料
凝固20~30min
混匀样品不能有气泡； 更换Tip。
反复煮沸3次、锥形瓶封口
10 μg/ml RNase A 10 mM Tris-HCl （pH 8.0） 1 mM EDTA （pH 8.0 ）
洗脱液 EB
质粒DNA提取——实验流程
对数期菌体 上清液
溶液I充分重悬
过柱
质粒DNA溶液
溶液II裂解
离心洗涤
溶液III中和
干燥溶解
质粒DNA提取——电泳检测
琼脂糖凝胶电泳检测
总RNA提取——样本准备
植物/动物组织样本：
新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80℃。 为避免反复冻融，需小份分装（50~100 mg/份）。
细胞样本：
新鲜收集待用或加入TRIzol后 -80℃冻存细胞沉淀。
血液样本：
新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入TRIzol后 -80℃ 冻存细胞沉淀。
一．核酸简介
二．基因组DNA提取
三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取
五．琼脂糖凝胶电泳
总RNA提取——通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）
原理： 核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一
部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电
荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向 疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水性， 因此向水层移动。
4.实验材料
对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5α）
质粒DNA提取——碱裂解法
碱裂解法试剂配方
组分1 Ⅰ液 Ⅱ液 25 mM Tris-HCl （pH 8.0） 0.2 M NaOH 组分2 10 mM EDTA（pH 8.0 ） 1% SDS
Ⅲ液
RNase A
3 M KAc （pH 4.2）
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法实验流程
植物材料
抽提
离心洗涤
液氮研磨
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
核酸沉淀
DNA溶液
基因组DNA提取——SDS法
SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能 裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白 质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；
质粒DNA的三种带型： 1.共价闭合环状DNA分子： 质粒双链没有断裂；超螺 旋结构；泳动速度最快； 2.半开环质粒DNA分子： 质粒的一条链断裂；松弛 的环状分子；泳动速度最 慢； 3.线性DNA分子：质粒的 两条链均断裂；泳动速度 居中。
质粒DNA提取常见问题
RNA残留
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ质粒断裂 量少
质粒DNA提取常见问题分析
RNA残留
忘记加RNase A？ I液中RNase A失效？ 酶量不够？
质粒断裂
II 液裂解时间过长？ 裂解时动作过于剧烈
质粒DNA提取常见问题分析
量少
凝胶是否有问题？ 菌体量少 菌体重悬不彻底 裂解不完全 菌株老化 严谨型质粒
质粒类型
真核细胞总RNA提取——实验步骤
293细胞样品为例
收集细胞 上层溶液
干燥溶解
裂解变性
异丙醇沉淀
RNA溶液
抽 提
离心洗涤
RNA提取常见问题
RNA降解 DNA残留 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常
RNA降解
外源RNase的污染 裂解液质量 裂解液用量不足 样品本身富含RNase 环境温度过高
小鼠gDNA电泳图
基因组DNA提取常见问题
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR 反应
DNA降解 DNA量少