游离氨基酸的测定实验方案
（茚三酮比色法）
一、实验目的
茚三酮比色法测定发酵液中游离氨基酸含量，利用氨基酸含量这个参数，控制发酵过程。

二、实验原理
游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量。

因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。

三、实验材料
发酵液样品；
实验试剂：水合茚三酮；氨基酸标准液；0.1%抗坏血酸
实验仪器：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；移液器；枪头；沸水浴；具塞刻度试管20 ml×10；分光光度计
四、实验方法
1.溶液配制
（1）水合茚三酮称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。

（2）氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml（含氮为50ug/ ml），取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。

（3）0.1%抗坏血酸称取0.1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配。

2.标准曲线绘制
取6支20ml 试管，按下表加剂：
试剂
管号
1
2 3 4 5 6 亮氨酸标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 抗坏血酸(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 氨基氮量（ug/管 ）
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min ，取出后立即用冷水摇
动冷却，用60%乙醇定容至20 ml ，摇匀。

λ=570nm 处测定吸
光度
0 0.025 0.055 0.099 0.146 0.186
以吸光度为纵坐标，氨基氨ug 数为横坐标，绘标准曲线如图：
茚三酮比色法测定游离氨基氮标准曲线
-0.05
00.05
0.10.15
0.2氨基氮（ug）
吸光度A
3.样品中游离氨基酸的测定
取20ml 试管，取待测液1ml ，加蒸馏水l ml ，水合茚三酮3.0 ml ，坏血酸0.1ml ，混匀，封口。

沸水浴加热1 5分钟，冷水中摇动冷却，用 60%乙醇定溶至20ml ，摇匀，于570mn 测定吸光度。

五、结果统计
测得吸光度，由标准曲线得知样液的氨基氮ug/ ml m，代入公式十算：
A=0.0382m-0.0103
式中：A为吸光度，代入公式算得m（ug/ ml）。