华南农业大学硕士研究生学位论文开题报告学号:2013200215姓名:任毅学院:生命科学学院专业(领域):植物学研究方向:观赏植物生物技术导师姓名:杨跃生攻读学位:硕士学位2015年3月15日论文题目三倍体紫锥菊的变异与花药培养选题来源自选论文类型应用基础研究开题日期2014年3月涉密否一、立题依据（包括研究目的、意义、国内外研究现状和发展趋势，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。
附主要参考文献目录）紫锥菊（Echinacea purpurea L.）是菊科（Asteraceae）紫锥菊属（Echinacea）的多年生草本植物，原产于美国中东部和加拿大南部（李鹏等，2007）。
紫锥菊中含有多糖，咖啡酸衍生物，烷基酰胺等化合物，具有提高机体免疫力和抗炎的作用，是国际上最受重视的少数几种药用植物之一（李继仁等，2002；王弘，2001；Barrett B，2003)。
1紫锥菊基本概述目前，国际上对紫锥菊的研究已经从多方面开展，最主要的是紫锥菊的有效成分及药理活性，而与本报告关系密切的组织培养和遗传育种等方面也有一定程度的研究。
紫锥菊中的有效成分之一是多糖及糖蛋白。
对紫锥菊的水相提取进行分离和药理活性测试得到两种具有免疫活性并且相对分子质量在35,000~450,000的多糖（岑国栋等，2010）,紫锥菊所含的多糖成分能够刺激巨噬细胞杀伤肿瘤细胞，抗菌和增强机体免疫力的功能（张莹等，2001；肖培根，1996）。
咖啡酸衍生物是紫锥菊中另一类重要的药理活性物质，紫锥菊地上部分及其根的乙醇提取物中含有咖啡酸类衍生物,包括菊苣酸、绿原酸、咖啡酸、紫锥菊甙等，紫锥菊咖啡酸衍生物中主要为菊苣酸。
菊苣酸具有增强免疫抗炎功能,并能抑制透明质酸酶,保护胶原蛋白Ⅲ免受可导致降解的自由基的影响（吴华, 2010；张广求，2010）。
2紫锥菊的组织培养与遗传育种的研究（1）紫锥菊的组织培养技术的建立由于紫锥菊具有巨大的药用价值，对紫锥菊的优质，高产提出了新的要求。
植物组织培养技术为解决这一问题提供了新的途径（Abbasi et al,2007）。
Zobayed等让人利用两种细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤（BAP）和苯基噻二唑脲（TDZ）分别与生长素吲哚乙酸（IAA）结合使用，利用紫锥菊的叶柄作为外植体，分别诱导出了体细胞胚和不定芽（Zobayed et al，2003a）。
Choffe等人利用吲哚-3-丁酸从紫锥菊的子叶和胚轴诱导出根器官（Choffe et al，2000）。
Koroch等人用细胞分裂素BAP和生长素NAA从紫锥菊的叶片诱导出不定芽，证明以紫锥菊叶片为外植体获得无菌苗是一种可行的方法（Koroch et al，2002）。
Zobayed等人利用紫锥菊叶片，子叶和根外植体诱导不定胚，在添加有细胞分裂素BAP和生长素吲哚-3-丁酸的培养基中均诱导出体细胞胚，并且14天的暗培养条件能够有利于出胚率，体细胞胚在无激素的培养基上萌发后转入添加有生长素萘乙酸（NAA）的培养基中能够正常生根（Zobayed et al，2003b）。
所以紫锥菊的胚轴，子叶，叶片，叶柄和根均能够作为外植体获得无菌苗，同时也说明紫锥菊同样能够以胚胎发生途径和器官发生途径形成不定芽。
随后的研究表明，不同的基因型对激素的反应是不同的，Li等利用6个田间表型不同的紫锥菊作为原始材料，研究对不同BAP浓度的反应，结果表明，不同基因型以及不同外植体（叶片，叶柄和根）对同浓度的BAP的反应不同（Li et al，2013）。
Pan等从紫锥菊叶片中游离出原生质体并将原生质体培养成为完整植株，原生质体的成功培养将为获得新的种质资源提供新的途径（Pan et al，2004）。
至此，能够从细胞水平，组织水平均能能够成功诱导出紫锥菊的再生植株。
（2）紫锥菊的倍性育种在对紫锥菊的离体培养，不仅是要利用叶片，叶柄，胚轴和子叶等作为外植体建立紫锥菊的快繁体系，需要更进一步利用组织培养技术为手段进行各种遗传改良。
其中对紫锥菊的遗传育种的研究主要集中在多倍体的诱导方面。
因为药用植物加倍后，会出现植株巨大化，抗性增加和药用活性成分增加的优良性状（何韩军等，2010）。
Nilanthi等人利用二倍体紫锥菊的叶柄作为外植体，在MS培养基中利用120mg/L的秋水仙素处理7天，得到四倍体完整植株，与二倍体植株相比，在形态学上有明显的差异，四倍体植株气孔较大，次生根较多且成熟四倍体植株的花序较短（Nilanthi et al，2009）。
对紫锥菊的育种研究中利用的另一种重要的方法是花药培养技术。
Zhao等首先利用二倍体紫锥菊花药培养的方式，使花药中未成熟的小孢子经过脱分化和再分化的过程形成再生植株（Zhao et al，2006）。
花药培养的主要目的是进行单倍体育种和获得纯和的二倍体或者多倍体植株，缩短育种周期和提高育种效率。
自从花药培养技术建立以来，经过多年的研究与发展，已经与常规的杂交育种，远缘杂交育种，诱变育种和基因工程等形成配套的育种技术（周旭红等，2007）。
但是，花药培养受很多影响因子的控制。
材料的基因型，花粉的发育时期，预处理，培养基成分以及培养条件都能够影响小孢子发育形成愈伤组织（张绿萍等，2007）。
付迎军等探讨了花药培养诱导胚状体或者愈伤组织与材料基因型之间的关系，不同基因型的玉米，其诱导率之间的差异非常明显，总的来说杂交种的诱导率要比纯系高（付迎军等，2004）。
王延玲等研究表明,矮牵牛花药培养中单核期的小孢子易产生单倍体植株,双核期易产生二倍体植株,而双核晚期易产生三倍体植株（王延玲等，2006）。
庄军平等研究温度对辣椒花药愈伤组织形成的影响，结果表明在接种前将花蕾置于4℃条件下处理3~5天有利于遇上组织的形成（庄军平等，2001）。
本研究室在研究利用二倍体紫锥菊经花药培养形成单倍体的试验中，表明N6培养基对遇愈伤组织的诱导要优于MS培养基。
目前，花药培养还有很多问题没有解决，例如，由于花药培养容易受各部分组织的干扰，培养产物不可能全部由花粉发育而来，致使产生不同倍性的混杂体，这给再生植株起源的确定和染色体倍性鉴定带来了麻烦。
（3）组织培养过程中体细胞克隆变异体细胞克隆在早些时候仅仅用来描述在细胞培养和组织培养中的变异，目前而言的定义是在离体培养过程中，再生植株具有的一系列遗传学（例如倍性的改变和染色体结构的改变）和表观遗传学（例如DNA的甲基化）的改变，这种现象称为体细胞克隆变异（somaclonal variation SV）（Wang et al，2012）。
一方面，在植物组织培养过程中，不可控的体细胞克隆变异可能会造成某一性状的改变，这对组织培养又提出了新的挑战，另一方面，体细胞克隆变异会造成新的性状的产生，对于农作物或者经济作物而言，又是一种新的种质资源的来源（Larkin et al,1981）。
Michael等人综述了在植物组织培养过程中体细胞克隆变异的原因和检测方法，组织培养过程中变异的原因很多，例如外植体来源是嵌合体，转座子的活性，离体培养的方法，植物激素的种类和浓度，继待培养周期的长短都能导致变异。
对体细胞克隆变异的检测可以利用形态学的方法，生理生化的方法，细胞学的方法和分子生物学的方法。
形态学的方法比较直观，可以利用植株的高度，叶片的形态和色素的沉积等性状去判别。
但是，植株的生长状态受环境因子的影响比较大，不能反应植株遗传组成的指标。
生理生化的方法较形态学的方法较快和较早就能检测出变异，例如利用变异植株和正常植株对光照，植物激素的反应的差异，检测植株中代谢物的差异等。
细胞学的方法可以检测DNA和RNA的含量，统计染色体数目等（Michael et al，2011）。
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