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实验一 201402总蛋白测定 (2)
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 (第二版)
3.本法也可用于血清总蛋白浓度的标化, 但显色温度须控制在(25±1)℃的范围内, 以及使用经过校正的高级分光光度计(波长 带宽≤2nm,比色杯光径为准确1.0cm)进行 比色。然后再按下式计算标化结果:
血清总蛋白(g / L) Au ARB AB 5.1
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唯一的缺点是灵敏度较低,比酚试剂法低约 100倍。但本法的检出限为0.2~1.7g/L,已 能满足临床生化检验的需要。 本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、 最实用的常规方法。 临床上常见的血清蛋白定量法主要有双缩脲 法、临床折射计法、染料结合法和免疫比浊 法。
方法评价
双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关 系,与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无 明显关系,各种蛋白质的显色程度基本相同。 本法重复性好,RCV为4%,CCV为3.9%;线性范围 为0~140g/L;本法干扰少,使用单一的稳定试 剂,操作简便、快速,既适于手工操作,也便于 自动化分析,已被推荐为测定血清总蛋白的参考 方法。
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1、剂量反应曲线的建立方法
当建立一个新的分析方法的浓度范围尚未 确定时,为了能够较准确地测定出该方法的浓 度范围,不同浓度的设置宜适当多些,浓度间 隔要小些。此曲线除了标准浓度过高部分发生 弯曲(因浓度过高时,吸光粒子之间的平均距 离减小,粒子的电荷分布发生改变,使其相关 系数发生改变,导致对Beer定律的偏离)外, 其余大部分都呈直线,我们即可选取此直线段 浓度范围作为该方法的分析范围。
0.298
0.1
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式中0.298为蛋白质双缩脲络合物的比吸光 系数。即按Doumas双缩脲试剂的标准配方, 在上述规定的测定条件下,双缩脲反应液 中蛋白质浓度为1.0g/L时的吸光度。
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B
U
血清
-
0.1
标准液
-
-
蒸馏水
0.1
-
双缩脲试剂
5.0
5.0
37℃10min,在波长540nm处比色,以空白管调零,测定各管吸光度。查 标准曲线得结果:
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实验结果1
2、仪器编号 操作者 日期 室温
管号
1
2
3
4
5
6
吸光度1
吸光度2
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结果计算
直接从校准曲线上查得 从回归方程中计算 以校准曲线第3管的吸光度和浓度来计算, 计算公式为 血清总蛋白=AU/As×Cs
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参考范围
附表 血清TP与年龄和体位的关系
早产儿
36~60 g/L ≥3岁
60~80g/L
新生儿
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2.血清总蛋白校准曲线制作
从血清总蛋白的剂量反应曲线已知其 线性上限可达140g/L,因而要求在此范围 内制作校准曲线。校准曲线可提供实际检 测系统中浓度和吸光度的已知关系,从而 计算出标本的测定浓度。
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实验一 血清总蛋白测定及其校准曲线制作
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实验报告要求
实验目的 实验原理(仅限于本实验) 主要器材(可省略) 操作方法(以表格为主) 实验结果(以表格为主、原始数据) 计算(公式)与结果 讨论(对原理和方法学、对测定结果、影 响因素等)
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操作方法
1、系列标准浓度配制及校准曲线测定操作
管号
1
140g/L蛋白标准液 (ul)
0
2
3
4
5
6
20
40
60
80
100
去离子水(ul) 100 80
60
40
20
0
双缩脲试剂(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
40
20
0
双缩脲试剂(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
相当于蛋白质(g/L) 0 28.0 56.0 84.0 112.0 140.0
各管平行做3管,充分混匀,37℃10min,在波长540nm处比色,以第1管 或蒸馏水调零,测定各管吸光度。
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46~70g/L
1周龄
成人 44~76g/L 非卧床
7月龄~1岁 51~73g/L 卧床
1~2岁
56~75 g/L
64~83g/L 60~78g/L
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临床意义
1.血清总蛋白浓度降低 蛋白质合成障碍 蛋白质丢失增加:严重烧伤;大出血;肾 病综合征。 营养不良或消耗增加 血浆稀释
平均吸光度
相当于蛋白质(g/L) 0 剂量反应曲线 y=ax+b
28.0 r2=
56.0
84.0 112.0 140.0
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实验结果2
2、仪器编号 操作者 日期 室温 管号
U1
U2
吸光度1
吸光度2 平均吸光度
相当于蛋白质(g/L)
光度,用目测法绘出一条通过零点、呈45度角 的直线,使直线所通过各点的垂直距离最短。
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3、对剂量反应曲线线性的评价
(1)审核平行管吸光度,对其中的离群值进 行检验剔除。简单的方法是将吸光度相差 大于0.005的数据弃去。
(2)建立线性回归方程y = a + bx ,a为截 距,b为斜率。
相当于蛋白质(g/L) 0 28.0 56.0 84.0 112.0 140.0
各管平行做3管,37℃10min,在波长540nm处比色,以第1管或蒸馏水调 零,测定各管吸光度。
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操作方法
2、双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤
加入物(ml)
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临床意义
2.血清总蛋白浓度增高 蛋白质合成增加:多发性骨髓瘤。 血浆浓缩:如急性脱水 外伤性休克 慢性肾上腺皮质功能减退
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注意事项
1.黄疸血清、严重溶血;葡萄糖、酚酞及溴磺酞钠 对本法有明显干扰,故用标本空白管来消除。
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2、校准曲线(实际工作中使用)的制备方法
(1)以5-7点为宜,标准物浓度都必须在吸光度-浓 度线性范围的限度内。
(2)每个浓度平行测定3-5管,取平均数作图。 (3)用经过校正的1级吸量管的同一刻度段准确加
标准液,尽可能减少加样误差。 (4)在直角坐标纸上以横坐标为浓度,纵坐标为吸
。
以校准曲线第3管的吸光度和浓度来计算,计算公式为
血清总蛋白g/L=AU/As×84
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实验目的
1、掌握血清总蛋白测定原理和方法 2、掌握校准曲线的概念、作用和制作方法 3、熟悉方法影响因素和方法评价
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2.高脂血症混浊血清会干扰比色,可采用下述方法 消除:取2支带塞试管或离心管,各加待测血清 0.1ml,再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml,塞紧并颠 倒混匀10次后离心,倾去上清液,将试管倒立于 滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲 试剂及双缩脲空白试剂,再进行与上述相同的其 他操作和计算。
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(3)计算相关系数r,一般校准曲线的r值要 求为0.9999或0.9997以上。
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实验原理
1.血清总蛋白测定
血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液 中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此 反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲(H2N-OCNH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的 反应相似,故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合 物在540nm处有明显吸收峰,吸光度在一定范围内与 血清蛋白含量呈正比关系,经与同样处理的蛋白质 标准液比较,即可求得蛋白质含量。
37℃10min,在波长540nm处比色,以空白管调零,测定各管吸光度。
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操作方法
2、系列标准浓度配制及校准曲线测定操作
管号