实验步骤
1、洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。 3、制作12%分离胶。按下表中所列顺序加试剂，轻轻摇 匀，加入两块玻璃板间。 4、用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约15min， 至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用 滤纸条吸干残余的水。 5、倒出水并用滤纸吸干，配好5%浓缩胶，轻轻摇匀，加 入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约20分钟。
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
实验目的
掌握SDS-PAGE检测蛋白分子量原理
和方法
掌握垂直板电泳的操作方法
实验原理

蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了 各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对 数呈线性关系：
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析

谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合） GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B） GST融合目标蛋白 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白


GSH- Sepharose 4B
亲和层析 分离纯化目标蛋白
实验目的

掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原 理和实验方法（第一部分） 掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理和方法 （第二部分）

第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白
亲和层析原理
生物大分子与配体特异非共价可逆结合

酶-底物 酶-底物类似物（酶的竞争性抑制剂） 抗体-抗原 激素-受体 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT）
实验试剂
低分子量标准蛋白（Mark） 兔磷酸化酶B MW=97400 牛血清白蛋白 MW=66200 兔肌动蛋白 MW=43000 牛碳酸酐酶 MW=31000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14400
30%丙烯酰胺（Acr） 10%SDS 1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 10%过硫酸铵(AP)（现配现用） TEMED（四甲基乙二胺） 2样品缓冲液 10电极缓冲液母液（pH8.3） 染色液
样品制备


待纯化蛋白：GST标记的纤维素酶 来源：重组大肠杆菌 提取方法：超声波破细胞释放GST-纤维素酶 条件：超声处理3秒，间歇5秒，共15分钟。 4000rpm离心5分钟，取上清（混合蛋白质溶液） 上柱。
SDS-PAGE样品制备
1号样： 过柱前的蛋白溶液25uL，加5uL 5X上 样缓冲液。 2号样： 洗脱的蛋白溶液（2号管）25uL，加5uL 5X上样缓冲液。 3号样： 洗脱的蛋白溶液（3号管）25uL， 加5uL 5X上样缓冲液。 点样前沸水中加热3-5min。
※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 ※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。
12%分离胶
试剂名称
ddH2O 30% Acr-Bis (29:1) 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 10% SDS TEMED（加速剂） 10% APS（催化剂，最后加） 总体积
实验步骤
6、将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子， 液面应该完全没过电极。
7、点样（Marker和待测蛋白样，加入样品缓冲液）每个点样孔点 30ul样品，每板胶点5ul Marker。
加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合
8、80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V；
GSH- Sepharose 4B
GSH- Sepharose 4B
实验步骤
一、装GST柱
1、清洗和装好层析柱，封闭出口。 2、加入2 mL PBS。 3、取1 ml GSH- Sepharose 4B填料，加入 柱子中。 4、打开柱子出口，使PBS缓慢流出。
注意：始终保持柱内的液面高于填料

logMW=K-bm
连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝 胶浓度相同。 电荷、分子筛效应。
不连续系统: 缓冲液离子成分、pH、 凝胶浓度及电位梯度的不连续性。 电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。
浓缩效应
（三个不连续性） 1、凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶）
2、缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3 种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低， 比Gly高。 3、电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形成高电位 梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位 梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳 极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中 间层。
12%分离胶
2.5 mL 3.0 mL 2.0 mL 75 uL 10 uL 75 uL 7.5 mL
5%浓缩胶
试剂名称 ddH2O 30% Acr-Bis （29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8） 10%SDS TEMED 10%AP（最后加） 总体积 5% 1.7 mL 0.43 mL 0.31 mL 25 uL 10 uL 25 uL 2.5 mL
二、纯化目的蛋白
1、用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。
2、将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3、用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4、加入1ml 洗脱液。 5、用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集 0.2ml（约4滴）。 6、PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7、将第2管和第3管用于目的蛋白的检测。
9、溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束
10、撬开玻璃板，将凝胶做好标记， 放在塑料盒内，加入染色液， 染色30min左右。 11、染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色。
实验结果分析
绘制标准曲线：log MW Fra bibliotek K - bm
蛋白质区带中心至分离胶上沿距离 相对迁移率= 溴酚蓝至分离胶上沿距离 以每个蛋白标准的分子量对数作纵坐标，相对迁移 率作横坐标，作标准曲线，然后在计算出待测蛋白的迁 移率即可在标准曲线上查出其分子量。