开题报告生物工程地衣芽孢杆菌变异株发酵工艺研究一、选题的背景与意义地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)属硬壁菌门（Firmicutes）、杆菌纲（Bacilli）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）、芽孢杆菌属（Bacillus）。
由于地衣芽孢杆菌安全性高、生长快速、抗逆性强、有高效的产酶能力、在较高温度下仍可存活等特点而被人们所广泛应用。
近年来, 国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。
在发酵产酶、医药、饲料加工、农药等行业, 取得了较好的研究成果。
根据文献显示, 关于地衣芽孢杆菌的专利有: 用地衣芽孢杆菌生产生物农药的方法; 地衣芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂; 地衣芽孢杆菌T1菌株的构建及其粗酶提取物的发酵生产; 利用基因突变技术, 改变地衣芽孢杆菌NCIB8061 a-淀粉酶的耐温性和耐酸性酶的性质等。
本实验室在经60Co照射后的东海香参中分离得到一株能高效分解东海香参的菌株A，对该菌进行形态学特征、生理生化指标、16S rDNA和MIDI全自动微生物鉴定等发现其为地衣芽孢杆菌。
该菌株为突变株，因此对其在医药和产酶等功能方面的研究具有重大的意义。
二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）基本内容：1.碳源种类对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响2.碳源量对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响3.氮源种类对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响4.氮源量对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响5.金属离子对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响6.初始PH值对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响7.接种量对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响（二）拟解决的主要问题：浒苔水解最佳条件摸索，检测指标的选择将成为主要问题三、研究的方法与技术路线：（一）实验安排以碳源种类、碳源量、氮源种类、氮源量、金属离子、初始Ph值、接种量为变量进行单因素实验：1．碳源种类在基础培养基中分别添加浓度为7.5%的不同碳源：麦芽糖、蔗糖、环糊精、葡萄糖、可溶性淀粉和浒苔，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力2. 碳源量在基础培养基中分别添加浓度为2.5%、3.5%、4.5%、5.5%、6.5%、7.5%、8.5%、9.5%不同浓度最佳碳源，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力3. 氮源种类在基础培养基中分别添加浓度为3％的不同氮源:干酪素、牛肉膏、酵母浸膏、大豆蛋白、明胶、尿素、硫酸铵、蛋白胨，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力4. 氮源量在基础培养基中分别添加浓度为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%等不同浓度的最佳氮源，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力5. 金属离子在基础培养基中分别添加浓度为0.002％的不同微量金属元素：Mg2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Sn2+、Cu2+、Ba2+、Li+、Fe3+、Zn2+，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力6. 初始pH值调节培养基初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 和12.0，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力7. 接种量分别按照2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%和16%的添加水平，接种培养12h的种子培养基于发酵培养基中，测定发酵液蛋白酶比活力（二）技术路线：样品采集—→富集分离纯种—→产碱性蛋白酶发酵培养基选择—→对不同培养基成分进行单因素实验—→运用响应面软件主效分析确定七个主要因素—→在根据响应面软件进行七因素七水平实验确定最优发酵培养基的配方—→运用最佳培养基配方对发酵各个条件进行单因素实验—→运用响应面软件根据上诉同样的方法确定出最佳发酵条件四、研究的总体安排与进度：2010.08——2010.091．实验前的准备工作：查找资料，文献综述的撰写，英文参考文献的翻译；2．文献整理，实验方案的确定；2010.09——2010.111. 开展实验；2．优化实验方案中的各条件；3．获得实验过程中的各类数据。
2011.02——2011.031．整理和补充相关数据，整理实验结果；2．撰写论文初稿。
3．论文定稿。
五、主要参考文献：[1] 荆谷，冯静，孔健，等．微生物金属蛋白酶研究进展[J]．生物工程进展，2002，22(1)：61-63．[2] 王吉庄，钟芳，王璋．高水解度大豆肽的制备[J]．食品工业科技，2003，24(9)：40-42．[3] Hadj-Ali N.E., Agrebi R., Ghorbel-Frikha B.,et a1.Biochemical and molecular characterization of a detergent stable alkaline serine-protease from a newly isolated Bacillus liehenifonnis NHl [J].Enzyme and microbial technology,2007,40:515-523.[4] Pan T.,Lin S. J...Fermentative production of alkaline protease as detergent additive [J].ChineseBiochem Soc , 1991, 20: 49-60.[5] Bakhtiar S.,Estiveira R.J.,Hatti-Kaul R..Substrate specificity of alkaline protease from al kaliphilic feather-degrading Nesterenkonia sp.AL20[J].Enzyme and Microbial Technology,2 005.37(55):534-540.[6] 蔡雁，郝勃，喻子牛．抗动物病原菌芽孢杆菌的筛选、初步鉴定和抗菌活性[J] ．微生物学杂志，2005．25(5) ：19-22．[7] 唐丽娟，纪兆林，徐敬友，等．地衣芽孢杆菌W10对灰葡萄孢的抑制作用及其抗菌物质[J]．中国生物防治，2005，21(3) ：203-205．[8] Johnson B.A., Anker H., Meleney F.L..A New antibiotic reduced by a member of the B.subtilisgroup[M]. Sci,1945,102:376-377.[9] 赵婷，梁秀芝，刘成君．皮革霉变真菌的分离鉴定及拮抗菌的筛选[J] ．中国皮革，2005，34(23)：10-13．[10] 唐娟，张毅，李雷雷．等；地衣芽孢杆菌应用研究进展；湖北农业科学；2008，3，351-354．[11] Potumarthi R.,Subhakar Ch..Alkaline protease production by submerged fermentation instirred tank reactor using Bacillus licheniformis NCIM-2042:Effect of aeration and agitation regimes[J]. Biochemical Engineering Journal, 2007, 34:185 - 192.[12] 马永强，那治国，张娜，等．地衣芽孢杆菌2709高去酰胺活性碱性蛋白酶发酵条件及酶学性质的研究[J]．食品工业科技，2008，29(10)：81-85．[13] 章海锋，阮晖，刘婧，等．地衣芽孢杆菌ZJUEL31410产胞外弹性蛋白酶的分批发酵研究[J]．中国食品学报，2009，9(1)：130-136．[14] SB/T 10317-1999．蛋白酶活力测定法．[15] 史锋．生物化学实验．杭州；浙江大学出版社，2002：92-93．[16] Kail S.J., F.Maugeri, Rodrigues M.I. . Response surface analysis and simulation as a tool forbioprocess design and optimization [J].Proc Biochem, 2000, 35:539-550.[17] Li Y., Cui F.J.,Liu Z.Q..et.a1.Improvement of xylanase production by Penicillium oxalicumZH-30 using response surface methodology[J].Enzyme and MicrobialTechnology,2007,40:1381-1388.毕业论文文献综述生物工程地衣芽孢杆菌变异株产蛋白酶的研究摘要:地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌安全性高、生长快速、抗逆性强、有高效的产酶能力、在较高温度下仍可存活等特点而被人们所广泛应用。
本文对国内外研究现状及展望进行了概述。
关键词：地衣芽孢杆菌；蛋白酶；现状引言地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)属硬壁菌门（Firmicutes）、杆菌纲（Bacilli）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）、芽孢杆菌属（Bacillus）。
由于地衣芽孢杆菌安全性高、生长快速、抗逆性强、有高效的产酶能力、在较高温度下仍可存活等特点而被人们所广泛应用。
在工业用酶当中，蛋白酶是用量最大、应用最广的一种，约占整个酶制剂产量的60%以上，广泛应用于食品、饲料、纺织和洗涤等领域[1]。
食品生产用蛋白酶分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶，其中微生物具有资源广泛、生长繁殖快和培养方法简单等优点，所以，采用发酵工程技术生产蛋白酶，原料便宜，不受土地和季节的限制，是生产蛋白酶的优良方法[2]。
用于食品加工的蛋白酶可以由多种菌种生产，其中，地衣芽孢杆菌在蛋白酶生产中的应用较为广泛。
Potumarthi,R.等用地衣芽孢杆菌进行深层发酵产碱性蛋白酶，通过对通气量和搅拌速度研究，在通气量为3 vvm，搅拌速度为200 rpm时，发酵72 h，碱性蛋白酶的含量最高，为102 U/mg[3]。
马永强等对地衣芽孢杆菌2709发酵生产高去酰胺活性碱性蛋白酶的发酵条件进行研究，以酶液对大豆蛋白的去酰胺度和肽键水解度为指标，对产酶条件进行优化[4]。
1 研究现状近年来, 国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。
在发酵产酶、医药、饲料加工、农药等行业, 取得了较好的研究成果。
根据文献显示, 关于地衣芽孢杆菌的专利有: 用地衣芽孢杆菌生产生物农药的方法；地衣芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂；地衣芽孢杆菌T1菌株的构建及其粗酶提取物的发酵生产；利用基因突变技术, 改变地衣芽孢杆菌NCIB8061 a-淀粉酶的耐温性和耐酸性酶的性质等，因此对其在医药和产酶等功能方面的研究具有重大的意义。