20 billion 2 × 150 bp Lower Cost Higher Cost
二代和三代测序技术的比较
Illumina测序仪的选择
二代和三代测序技术的比较
二代测序—Roche 454
Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。
二代和三代测序技术的比较
二代测序— Solid
二代和三代测序技术的比较
Ion Torrent—short reads
二代和三代测序技术的比较
Ion Torrent—long reads
二代和三代测序技术的比较
Ion Torrent 主要应用
靶向测序 转录组测序 异倍性和 CNV 分析 小分子 RNA 和 miRNA 测序 病毒分型 外显子组测序 微生物测序 通过测序进行基因分型 De Novo 从头测序
2. PacBio /SMRT
3. Oxford / Nanopore
4. Thermo / Ion Torrent
二代和三代测序技术的比较
三代测序—SMRT
• PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体。 • 4色荧光标记 4 种碱基，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。 • 通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，可以通过这个来之间检 测甲基化等信息。 • SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。 • DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一。 • 测序错误率比较高，通过多次测序纠错。
太平洋生物科 PacBio SMRT 学公司
实时单分子DNA测 荧光/光学 序
~1000
第三代
Ion Torrent/生 PGM 命技术公司
合成测序法
以离子敏感场效应 晶体管检测pH值变 100-200 化
牛津纳米孔公 gridION 司
纳米孔外切酶测序 电流
尚未定量
二代和三代测序技术的比较
有潜力达到高读长；可以成本生产 切断的核苷酸可能被读错方向；难 纳米孔；无需荧光标记或光学手段 于生产出带多重平行孔的装置
以及不稳定的微卫星标志物的完整序列；
• 靶向检测基因或大型基因组的特定区域，直接检测其变异，揭示耐药机制； • 更完整的测序帮助还原更全面的免疫反应原貌。
二代和三代测序技术的比较
三代测序—研究热点

基因组组装（2+3）


微生物16S分析
算法开发
二代和三代测序技术的比较
二代测序技术的比较
公司 平台名称 测序方法 检测方法 大约读长(碱 优点 基数) 相对局限性 样品制备较难；难于处理重复和同 在第二代中最高读长；比第一代的 种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错 测序通量大 误累积；仪器昂贵 很高测序通量 仪器昂贵；用于数据删节和分析的 费用很高
Pathogenic germline variants（MutSigCV） Copy number analyses
Intra-tumour heterogeneity
Nature communications, 2016, Breast cancer
二代和三代测序技术的比较
三代测序
1. 单分子测序
细菌分型
二代和三代测序技术的比较
三代测序技术应用
全基因组测序
从整体上以单碱基对分辨率检测结构
变异。 更高质的人类基因组全新组装；
靶向捕获测序
表征人类遗传疾病的复杂区域；


解决微生物和传染病研究中的复杂区域；
获得全长HLA等位基因变异而无插补； 表征复杂免疫区域的扩增单体型； 直接检测转录本的全长，消除了使用算法 对转录本进行重建的步骤
的方法，它的测③ 桥式PCR扩增与变性 ④ 测序
二代和三代测序技术的比较
Illumina测序仪比较
NextSeq 系列 HiSeq 系列 HiSeq X 系列 NovaSeq 系列
最大输出
运行时间
120 Gb
12-30 hr
1500 Gb <1–3.5 days（Hiseq 3000/4000） 7hr-6days (Hiseq 2500)
Survival analyses
Variant calling （SNV filtering，Indel filtering）
Driver gene identification ensure hotspots variants with low VAF (2-10%)
Clonal states of Mutdriver mutations
肿瘤发生发展机理 肿瘤分子标记物 肿瘤分子分型 肿瘤病理关联
遗传性肿瘤家系 队列研究
二代和三代测序技术的比较
队列分析—案例
Alignment and quality assessment Assess the sensitivity and specificity of variant calls
SOLiD使用连接法测序，基于“双碱基编码原理”获得SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编 码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量 引物reset
二代和三代测序技术 的介绍与比较
目 录
I.
II.
测序技术发展
二代测序
III. 三代测序 IV. 应用
二代和三代测序技术的比较
测序技术发展
2015
2012 2010
2008
2007 1998 1977 1966 1953 1925 DNA是 遗传物 质 DNA双 螺旋 遗传密 码 化学降解 和 Sanger 测序 第一台 自动测 序仪 1986 第一台 全自动 测序仪 3700 Illumin a Solexa GA测序 仪 ABI Solid System 2005 2006 Illumina HiSeq 系列 第一台 SMRT 测序仪 PacBio RS Ion Torrent 半导体 测序仪 PGM 第一台 基于 Nanop ore技术 的 MinION 和 GridIO N测序 仪
Beads固定
ECC
二代和三代测序技术的比较
二代测序— Solid
二代和三代测序技术的比较
二代测序—分析流程
Germline
二代和三代测序技术的比较
二代测序—分析流程
Somatic
二代和三代测序技术的比较
二代测序—临床应用
临床应用
在肿瘤临床中的应用优势
对比项 大片段检测 突变检测 检测灵敏度 传统方法 FISH Sanger 检测单 个基因 高通量测序 不受邻近片段 的影响 同时检测多基 因
Roche4 54
第一台单 分子测序 仪 Helisco pe
BGISE Q 500
人基因 组 2000
二代和三代测序技术的比较
测序成本
二代和三代测序技术的比较
二代测序技术
Illumina
ABI SOLID
Roche 454
二代和三代测序技术的比较
二代测序技术— Illumina
Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的机器采用的都是边合成边测序
THANK YOU


生育健康
癌症 遗传病


用药指导
传染病 移植分型
Sanger 15-20% 可以达到0.5% IHC， 芯片， qPCR

个体健康
表达量检测
完全定量
二代和三代测序技术的比较
二代测序—肿瘤研究
研究方向
研究方法
数据库及数据挖掘 TCGA Cosmic ONCOMINE UCSC Xena cBioPortal ... ...
二代和三代测序技术的比较
三代测序—Ion Torrent
Ion Torrent是一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术。
特点 基本原理
当DNA 聚合酶把核苷酸聚合到延伸 不需要昂贵的物理成像等设备，成 中的 DNA链上时，会释放出一个氢 本相对较低，体积小，操作简单； 离子，反应池H+离子 个上机测序可在2-3.5小时内完成； 信号， H+离子信号再直接转化为数 不过整个芯片的通量并不高，目前 字信号，从而读出 DNA序列。 是10G左右，适合小基因组和外显 子验证的测序。
化从而鉴定所通过的碱基。
二代和三代测序技术的比较
Nanopore 主要特点
• 读长长，大约在几十kb，甚至100 kb
• 错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在reads的两端;
• 数据可实时读取； • 通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成)； • 样品制备简单又便宜，不破坏DNA; • 直接读取甲基化修饰位点，准确率可达99.8%
二代和三代测序技术的比较
三代测序—Nanopore
Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术，是基于电信号的测序技术。
基本原理 当DNA碱基通过纳米孔时，使电荷发生 变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流 强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是
不同的），灵敏的电子设备检测到这变


生成高品质的植物、动物基因组；
同时检测表观遗传信息； 在单次实验中进行完整的微生物基因 组测序；
二代和三代测序技术的比较
三代测序在肿瘤研究中的应用
SMRT测序能够提供有关癌症基因组复杂性最全面的观点 • 通过对Iso-form多样性的完整检测（包括基因融合、剪接位点和内含子等）发现癌 症样本中隐藏的生物学机制； • 以极高的分辨率检测SV，包括CNV的基因组背景、插入/缺失/倒位/易位的准确断点