体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞体外成熟的质量评定
⑴ 形态观察：细胞质均匀、没有空泡
⑵ 固定染色法 ：0.1%透明质酸酶 醋酸 酒精或醋酸甲醇（1:3）固定24h～48h 1%间苯二酚兰（Lacmoid）或1%地衣红 （Orcein）的40%醋酸溶液染色
⑶ 受精和胚胎发育潜能的评定
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外成熟
卵母细胞成熟培养液 以TCM-199较好，可使牛、羊、猪的卵 母细胞体外成熟率高达80%以上。 添加成分： • 促性腺激素：FSH、LH • FCS、BSA：有认为FCS比BSA好，而发情 牛血清或发情羊血清比FCS好。 • 抗生素
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外成熟培养
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外成熟
卵母细胞成熟的标志 第一极体的排出、卵丘细胞的扩展可作为成熟的标 志，而生发泡破裂(GVBD)是卵母细胞恢复减数分裂的主 要标准，因此常用地衣红染色才可判断。 牛卵母细胞体外成熟标准： 1级成熟卵：卵丘细胞完全扩展，卵丘细胞至少向外扩 展3倍于裸卵直径； 2级成熟卵：卵丘细胞中等扩展，卵丘细胞至少向外扩 展2倍于裸卵直径； 3级成熟卵：卵丘细胞轻度假扩展，卵丘细胞仍紧紧粘 附于透明带上。 1级和2级卵通常均已排出第一极体。
体 外胞的体外成熟培养
2. 成熟培养时间 一般22h-24h，但猪40h-44h，马30h-36h，兔 仅12h-15h 3. 成熟培养的温度和气相环境 人和啮齿类动物：37℃ 牛、猪、羊和马等：38℃~39℃。 pH：7.7好于7.1，7.4，8.0 渗透压：330 Osm/kg好于300，320 气相： 5%CO2 5%CO2＋5%O2＋90%N2
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外成熟
（2）卵母细胞的形态 A、 76.2%； B、67%； C、22%； D、11.4% （3）卵巢贮存时间与温度 <30º C 对成熟和胚胎发育不利(First & Parrish） 绵羊的卵巢贮存在22º C数小时对成熟无明 显影响，但体温条件下则会使卵母细胞的质量 下降 (Moodie & Graham )
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的采集 ⑵ B型超声波法：超声波探头和采卵器插入到阴 道子宫颈的一侧穹隆处。术者通过直肠将卵巢 贴在探头上，根据B超屏幕上所显示的卵泡位 置进行穿刺而将卵母细胞抽出 优点：不用手术，操作速度快，对母牛损伤小， 可频繁采卵，且亦可对妊娠母牛采卵； 缺点：操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设 备。
（二）精子获能处理方法 3.卵泡液孵育法 卵泡液含有来自血清的大分子物质，并含 有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在精液 中添加一定浓度的卵泡液可诱发精子获能。 10%卵泡液，牛受精分裂率（40.3% Vs 87.5%）和囊胚发育率（8.3% Vs 40.4%）均 显著下降，但加入50%的卵泡内膜细胞条件液 则能 。 卵泡液可以用于精子的获能处理，但不能 用于IVF系统。
体外受精技术
体 外 受 精 的 概 念
狭义：将动物受精过程中的精卵结合在体外环 境下完成的现象。包括自然条件下的体外受精 (两栖类和鱼类)，和人为培养条件下的体外受 精(哺乳动物)。 广义：经过特殊处理的精子在体外使卵母细胞 受精的技术，所以体外受精的胚胎移植后所生 婴儿又称为“试管婴儿”。包括卵母细胞的体 外成熟和受精卵的体外培养两项配套技术。 优点：与体内受精相比，所需精子数减少，提 高精液利用率。 Example: 流式细胞含仪分离的性控精子只能用于体 外受精。
卵母细胞的体外成熟
影响卵母细胞成熟的因素 • 卵母细胞的来源：不同种类的动物、不同生理 阶段的动物(小牛低于成年牛)、卵母细胞的质量 等；
（1）动物种类与年龄： 牛、羊效果较好，而马、 猪较差。 小牛卵母细胞的平均直径 （118.04±1.15μm）比成年母牛的 （122.84±0.74μm）小。 体外成熟的小牛卵母细胞体外受精后发育潜 力也低于成年卵母细胞
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的采集与体外培养
1. 离体采集：30min内取卵巢，置生理盐水或PBS （25℃-35℃），3h内回收。 ⑴ 卵泡抽吸法： 针头穿刺，一次进针可抽吸卵巢 皮质的多个卵泡 优点：回收速度快，不易造成卵母细胞的污染； 缺点：容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞，影响 其随后的成熟。
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的采集
⑵ 卵巢解剖法：卵巢切为两半，去掉中间的髓质 部分，刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗 优点：能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回 收率也相对较高；
缺点：回收的速度相对较慢，容易造成污染。
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的采集 2. 活体采集(Ovum Pick-Up,OPU) ⑴ 腔镜法：腹壁切开一小口，插入腹腔镜，操作 杆和穿刺针，配合将卵母细胞抽吸出来 优点：比较直观，容易掌握； 缺点：工作量大，对母牛有损伤，不能频繁手术。
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
影响卵母细胞成熟的因素
培养条件： 温度：37C较好，但各种动物最适温 度不同，如兔子低于体温3C较好，牛 35-39C都可，但38-39C最合适； 培养基：水、血清（无血清、有血 清)、 无血清时添加BSA等；有血清时如胎 牛血清、发情牛血清、公牛血清、超排 牛血清等；
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外成熟
2. 激素 目前大多数都离不开FSH或LH或两者的混合 物，但仍有争议 GH能显著提高精子的受精率，促进卵裂及 胚泡的形成 甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP） 胰岛素 激活素
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外成熟
3. 生长因子 目前已经证实与卵母细胞成熟有关的生长因 子有：上皮细胞生长因子（EGF）、转化生长因 子α和β（TGF-α，β）、成纤维细胞生长因 子（FGF）、胰岛素类生长因子Ⅰ和（IGFⅡ-Ⅰ， Ⅱ） 4. 血清 胎牛血清（FBS）、发情牛血清（OCS）、发 情前期母牛血清（POS）、超排母牛血清 （SCS）、公牛血清（SS）。
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外成熟培养
4.IVM系统 ⑴ 开放培养系统 1ml-2ml成熟培养液直接置于平皿内或培养 板内，放入50枚-200枚卵母细胞培养，上面不 盖石蜡油。 优点：简单，对培养液中的脂溶性物质没有若 影响，能同时培养大量细胞 缺点：渗透压变化较大，容易污染
国 内 外 研 究 现 状
世界体外受精的首创纪录
动物种类 兔 叙利亚仓鼠 小鼠 中国仓鼠 猫 土拨鼠 大鼠 狗 牛 猪 绵羊 山羊 首创纪录文献 Thibault(1954) Yanaginmachi,chang(1963) Whittingham(1968) Pickworth,Chang(1969) Hammer(1970) Yanagimachi(1972) Miyamoto,Chang(1973) Mahi,Yanagimachi(1976) Brackett(1978) Iritani,Niwa(1977) Bondioli,Wright(1980) 花田章(1985)
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外成熟
卵母细胞成熟目的： 提供可利用的卵母细胞用于体 外受精、克隆等； 研究其体内成熟的模型。 卵母细胞体外成熟的特征 • 生发泡破裂； • 染色体凝集； • 纺缍体形成； • 极体排出； • 透明带软化； • 卵丘细胞扩展。
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外成熟培养
⑵ 微滴培养系统 将成熟培养液在做成50-500l的微滴，覆石蜡油， 将卵母细胞置于其中培养。 优点：渗透压比较稳定，不易污染； 缺点：对脂溶性物质有稀释作用，成本高，培养结果 易受石蜡油质量的影响。 ⑶ 密闭培养系统 置1～2ml培养液的试管中，胶塞，在培养箱或恒 温水浴中培养；若采用培养皿或微滴培养，则可将其 装入密闭的塑料袋内。 优点：不要CO2培养箱，方便运输 缺点：pH不如前者稳定。
（二）精子获能处理方法
1. 血清白蛋白法 将精子与血清白蛋白溶液进行长时间孵育 。
该法由于需要的时间较长，且诱发精子获能的作用 不强，故仅在IVF技术研究的初期进行过尝试，具有 一定作用，目前仅作为精子获能的一种辅助手段。
2. 高渗盐法 精子表面含有许多被膜蛋白，即所谓的“去能因 子”。当用高离子强度溶液处理精子时，这些被膜蛋 白将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。 由于高离子强度溶液对精子具有渗透打击作用， 会影响精子的活力，故目前已废除不用。
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
精子的分离、洗涤与体外获能
离心洗涤法：对于活力好的精子直接 将其放入获能液或受精液中，离心洗涤 若干次便可。 BSA/Percoll密度梯度离心法：利用 形态正常精子密度高于异常精子的原理。 如将BSA制成不连续的密度梯度或将 Percoll制成30-40%或45-90%梯度，经平 衡离心从而得到高受精力的精子。 玻璃棉过滤法：采作小玻璃珠过滤除 去死精子。因其成本高，较少采用。
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的筛选
只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵 丘脱落（B级）(1层以上卵丘细胞）、胞浆均 质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟 与胚胎发育的培养。 A级：卵丘细胞致密，至少有5层以上； B级：卵丘细胞为2-4层； C级：卵母细胞大部分被包裹； D级：卵母细胞少量被包裹； E级：裸卵。 A、B级可用于培养，C、D级成熟率低。
体 外 胚 胎 生 产 技 术 要 点
卵母细胞的体外保存
1. 37℃保存 应考虑保存时间与卵老化 2.低温保存 0℃-10℃ 兔:<10℃ 24h，受精率78％，78h仍可保持 受精能力；>10℃，受精能力显著降低。