X射线晶体衍射分析(X-ray Crystallography, X-ray Diffraction Methods)梁毅(武汉大学生命科学学院)测定生物大分子三维结构的主要方法z完整、精确、实时(动态)地测定生物大分子三维结构的主要研究对象包括核酸、蛋白质、寡糖、脂以及它们之间的复合物。

z直接测定生物大分子三维结构的主要实验方法有:X射线晶体衍射分析(亦称X射线结晶学或晶体结构分析)、多维核磁共振(NMR)技术、电子晶体学（电镜三维重组）、扫描隧道显微技术(STM)和原子力显微技术(AFM)。

z伦琴（Röntgen）发现X射线（1895年）及其后劳埃（Laue）发现晶体的X射线衍射（1912年），从而开创了晶态物质结构研究的新纪元。

z1953年Perutz在当时的同晶置换原理上，发现了重原子同晶置换法可以解决生物大分子晶体结构测定中衍射的相位问题，从而X射线晶体衍射分析开始踏上了自己发展的伟大历程。

z在1957年和1959年Kendrew和Perutz分别获得了肌红蛋白和血红蛋白的低分辨率（6 Å和5 Å）结构，在此期间Watson和Crick共同建立了DNA双螺旋的结构模型。

他们的伟大成就为分子生物学奠定了基础。

z上述4位科学家分别获得1962年度Nobel化学奖和生理或医学奖。

z从1957年到1967年的十年里，在溶菌酶结构之后，胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶等也分别获得了高分辨率的晶体结构，表明X射线晶体衍射分析已经成为一门成熟的学科。

z今天的生物大分子晶体学已经完全超越单纯晶体结构测定的本身，而是直接瞄准待测结构的生物大分子的功能，瞄准那些与功能紧密联系在一起的生物大分子复合物的晶体结构，如酶与底物(DNA聚合酶—DNA)、酶与抑制剂(溶菌酶-(NAG)3)、激素与受体(人生长激素与其受体)、抗原与抗体(流感病毒神经氨酶-单克隆抗体)、DNA与其结合蛋白(TATA box与其结合蛋白)等。

z现在，生物大分子晶体学已被应用到测定由许多生物大分子组成的极其复杂的大分子组装体(Macromolecular assembly)的晶体结构，如组成细胞骨架的微管系统(Microtubules)、由200多种不同的蛋白质组成的细菌鞭毛(flagella)和由60个不同的蛋白质分子和3条RNA链组成的分子量高达230万的核糖体等。

其中核糖体大亚基的分析已达2.9埃分辨率，是当前X射线晶体结构分析的一个突破。

z现在，生物大分子晶体学已不再满足于静态晶体结构的测定，而追求与生物大分子发挥生物功能相伴随的动态晶体结构的测定。

生物大分子及其复合体的结构不是刚性的，而是有柔性的，存在着在不同层次的不同自由度的运动，它们是生物大分子发挥生物功能的基础和条件。

另一方面，生物大分子发挥功能的过程就是和其他分子相互作用的过程，也是构象变化的过程．因此生命的结构必然是运动的结构，晶体结构分析也必须分析晶体结构的运动。

z那么，生物大分子在晶体状态下的结构是否反映了在有机体内的真实结构?z回答是肯定的。

实验结果表明，大部分生物大分子的晶体结构(crystal structure)接近于其用核磁共振技术测得的溶液结构(solution structure)。

z综上所述，X射线晶体学可在原子或接近原子的水平上分析蛋白质的精细三维结构，并适用于研究各种大小蛋白质的结构，甚至可以测定全病毒和核糖体的结构。

晶体结构提供的是静态（在一定程度上也表现出动态），但是极为精确的一个个蛋白质分子堆积于晶体中的画面。

z X射线晶体衍射曾经是蛋白质结构测定的唯一手段，并且在现在和可见的将来仍将是原子水平上解析蛋白质结构的最主要和最有效的手段。

生物大分子晶体结构分析步骤z第一步克隆、表达、纯化：解析蛋白质晶体结构的前提是制备均一的蛋白质样品并获得晶体。

因此获得表达量高，纯化效果好的蛋白对后续步骤，特别是结晶起到及其重要的作用。

z第二步结晶：在大多数情况下，蛋白质结晶是工作的瓶颈，需要通过大量的条件筛选和优化以使蛋白质分子间的弱相互作用促使蛋白质分子形成高度有序的晶体而不是随机聚合形成沉淀。

z第三步数据收集及处理：通常利用（单波长）X射线光束照射在一定角度范围内旋转的蛋白质晶体，同时记录晶体对X光散射的强度。

z这些强度可转换为结构测定中的结构因子的振幅（|F(hkl)|）。

此外, 在Laue法中, 晶体通常保持静止而使用连续X光波长（白光）收集数据。

z第四步相角的测定：结构因子的振幅（|F(hkl)|）及相角（α(hkl)）是物理上相对独立的量。

由于结构因子相角的全部信息在收集数据时丢失, 因此必须通过其它途径来得到它们的信息。

z第五步相角的改进（优化）：电子密度图的质量及其后的可解释性主要决定于相角的准确性。

有的情况下采用晶胞中不对称单位中的等同部分（例如，一个以上的等同分子）的电子密度平均，有可能大大地改善误差较大的起始相角。

z第六步电子密度图的解释：相位确定后,可开始计算电子密度图。

若从电子密度图能跟踪出肽链走向和分辨出二级结构（如基于高分辨率的数据，通常这意味着衍射数据的分辨率至少达到3.5 Å），则可能推出多肽链的三维折叠方式。

z进而根据氨基酸序列，就可能构建出原子坐标形式的蛋白质结构模型。

z第七步修正：考虑到已建立的立体化学资料（如键长，键角等）的限制，根据X射线衍射数据对初始的蛋白质分子模型进行修正。

z第八步：结构的描述和与功能关系的研究。

结晶方法和技术z汽相扩散法（Vapour diffusion）:微量蒸气扩散法主要是通过在一个封闭体系内，在能使某种蛋白质结晶的较高沉淀剂浓度的溶液与含有较低沉淀剂浓度的蛋白质溶液之间发生蒸汽扩散，最后两者达到平衡，蛋白质溶液内沉淀剂浓度逐渐增加使得蛋白质的溶解性降低，达到过饱和析出而结晶。

z这种方法现在使用最为广泛，可以分为悬滴法，坐滴法和三明治法。

蛋白质结晶条件的优化z首先确定晶体是蛋白晶体，还是盐晶。

要知道这点，可以在X光机上收集几幅衍射图，如果在低分辨率有衍射点，就是蛋白质晶体。

如果只在高分辨率有衍射点，就是盐晶。

z另外，捞取晶体制备电泳样品，如果电泳结果显示目的蛋白带，应该是蛋白晶体，否则就是盐晶；用Hampton公司的IZIT染料或甲基绿染色，蛋白晶体可以被染色，盐晶不能染色。

结晶时做不含蛋白的空白对照也是确定蛋白晶体的一个好办法。

晶体的结构特点z晶体是原子或分子在三维空间中周期性重复排列形成的结构。

z点阵结构：任何能为平移复原的结构称点阵结构。

能使一点阵结构复原的全部平移形成一个平移群ua+ vb+ wc，称为该结构的平移群。

u，v，w 为整数，a，b，c 为三个非共面的向量。

点阵结构与其相应的平移群必存在下列关系：（1）从点阵结构中某一点指向点阵结构中的每一点的向量都在平移群中。

（2）以点阵结构中任一点为起点时，平移群中每一个向量都指向结构中一个点。

z晶胞：从一个空间点阵结构中一定可以划出一个平行六面体，这一平行六面体称晶胞，每一晶胞可用a，b，c，α，β，γ六个参数来描述，这六个参数称晶胞参数。

z点阵结构是很有规律的结构，除了上述的平移群能使它复原外，还存在另外一些能使其复原的对称元素，如对称中心（倒反），镜面，旋转轴，旋转反轴，空间点阵结构中只能容纳有限的几种旋转轴，即二重轴、三重轴、四重轴及六重轴，所以其最基本的对称元素只有七种。

z根据晶胞形状，也就是六个晶胞参数，以及晶胞中所容纳的特征对称元素，可以把不同的晶胞分成七个类型，即七个晶系:立方,六方,四方,三方,正交,单斜和三斜。

z晶胞参数的特征是各个晶系的宏观表现，是区分七个不同晶系的必要条件但不是充分的条件，只有特征对称元素是区分晶系的关键所在。

z两个对称元素的结合就会产生新的对称元素，在七个晶系中把特征对称元素与基本对称元素进行组合，就会产生32种不同的对称元素组合，这就是32个点群。

z有时为了获得较高的对称性，把原有晶胞扩大，使成为带心的晶胞，由此在七个晶系中可以得到14种不同的布拉菲格子(Bravais lattices)，不带心的晶胞称为素晶胞（P），带心的称为复晶胞（I，F，C）。

z把所有类型的对称元素与32个点群、14个布拉菲格子，按照一定规则的组合就可得到230种空间群。

z由于蛋白质晶体的对称元素只有对称轴（旋转轴和旋转反轴），没有镜面及对称中心（倒反），因此蛋白质晶体只有65种空间群。

z通过Denzo程序对衍射点分布信息的处理可以分析出晶体内蛋白质分子堆积的信息，即初步的晶体学参数，包括晶胞大小和布拉菲格子类型等。

在对每个衍射点的（h，k，l）进行指标化和积分后，以进一步用Scalepack程序并选择合适的空间群对这些衍射点的强度进行归并。

z Scalepack程序处理结果中的完整度（Completeness），冗余度（Redundancy）以及衍射强度R因子（R）等参数可以初merge步判断该套数据的质量。

z对于一套完整的数据，往往要求完整度大于80％，而且缺失数据在倒易空间中应随机分布；冗余度达到2～3以上，衍射强度R因子最好处于3%（良好的衍射数据）～11%（较弱的衍射数据）之间。

z晶体的质量有赖于晶胞中分子的有序性。

由于原子的热运动及统计无序性，原子位置不是严格固定的。

通常在高衍射角处，X射线的反射强度会下降。

发生衍射的X射线束可视为被晶格面散射形成。

晶格面间距离d及衍射角θ的关系式为：2d Sinθ= n·λ（布拉格定律）。

当衍射图案的最高分辨率相当于5 Å晶格间距时，分辨率较低，当为2.0~2.5 Å时分辨率一般，当为1.0-1.5 Å分辨率很高。

X射线晶体衍射分析的基本原理z X射线衍射结构分析主要基于两方面原理: z第一是衍射线的方向, 即衍射图上斑点的位置,用它可以确定晶胞的大小和形状。

衍射线的方向与晶胞大小的关系用劳厄(Laue)方程和布拉格(Bragg)方程描述。

z第二是衍射线的强度, 即衍射图上斑点的亮度或黑度, 用它可以确定晶胞中原子的空间排布。

衍射线的强度与晶胞中原子排布的关系用布拉格(Bragg)方程确定。

立叶变换。

其中，（x,y,z）为晶胞中某一点的坐标，V为晶胞体积，h,k,l）为衍射指标，|F（hkl）|和α（hkl）分别是指标为h,k,l）的衍射的结构振幅和相角。

显然，结构因子的两个部分－振幅和相角对计算电子密度来说都是必须的。

确定相位的主要方法z目前，在蛋白质晶体学中确定相位主要有3种实验方法，即多对同晶置换法（Multiple Isomorphous Replacement, MIR）、多波长反常散射法（Multiwavelength Anomalous Dispersion, MAD）和分子置换法（Molecular Replacement, MR）。