杆状病毒表达蛋白1 donor vector的构建1.1 外源基因的连接1.2 转化1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。

1.2.2 冰浴30min。

1.2.3 42℃，90s。

1.2.4 马上放入冰浴中，2min。

1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。

（LB 37℃预热）1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。

1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。

1.3 鉴定1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。

1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。

1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。

1.3.4 取1ml菌液测序。

1.4 菌种的保存1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。

1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。

1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。

1.4.4 -80℃保存。

2 转座2.1 转座反应2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。

2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。

2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。

pFastBac TM construct 1ng(5μL)pFastBac TM control 1ngPUC19 control 50pg2.1.4于冰中放置30min。

2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。

2.1.6 马上放入冰浴中，2min。

2.1.7 加入900μL室温LB培养基。

2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。

2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。

（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。

2.1.10 37℃，倒置培养48hr，挑取白斑进行分析。

2.2 鉴定2.2.1 挑取10个克隆于新鲜配制的LB平板中，画线，37℃倒置培养过夜。

2.2.2 挑取单菌落于LB液体培养基中，LB液体培养基含有50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet。

2.2.3 Bacmid DNA的提取，提取方法见附录3。

2.2.4 Bacmid DNA的PCR鉴定由于Bacmid DNA中含有M13的正向及反向引物序列，在转作子两端，所以可以用M13来扩增鞭毛蛋白基因。

M13 Forward :5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3M13 Reverse :5-CAGGAAACAGCTATGAC-3反应的条件为：93℃ 3min，（94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 5min）×25-35个循环，72℃ 7min。

2.2.5 取5-10μL PCR产物，0.7%琼脂糖电泳检测片段的大小，正确的片段大小为4000bp。

3 Bacmid DNA转染sf9昆虫细胞获得杆状病毒3.1 sf9昆虫细胞的培养（见附录4）。

3.2 Bacmid DNA 转染sf9昆虫细胞3.2.1 在6孔板中，每孔铺9×105个细胞，加入2ml含有抗生素（50u/ml的青霉素，50μg/ml 的链霉素）的sf-900II SFM培养基。

3.2.2 27℃至少培养1hr。

3.2.3 在灭菌管中混合Cellfectin及DNA。

将1μg DNA在100μL的sf-900II SFM培养基中稀释；将Cellfectin上下颠倒混匀5-10次，取出6μL，用100μL的sf-900II SFM培养基稀释；将稀释的DNA及Cellfectin混合，温和混匀，室温放置15-45min。

3.2.4 移去细胞中的培养基，加入2ml sf-900II SFM培养基洗涤，弃去洗涤液体。

3.2.5 在DNA：Cellfectin混合物中，加入800μL的sf-900II SFM培养基，温和混匀，加入细胞中。

3.2.6 27℃，培养5hr。

3.2.7 移去DNA：Cellfectin混合物，加入2ml含双抗的sf-900II SFM培养基。

3.2.8 27℃培养72hr，直到看到杆状病毒的标志。

如果转染效率高，72hr后就可看到细胞病变，如果转染效率不高，4-5天后才能看到。

3.2.9如果看到上述的细胞病变，将2ml的细胞收集于15ml的snap-cap管中。

3.2.10 500×g离心5min除去细胞及碎片。

3.2.11 将上清转移至新的灭菌15ml snap-cap管中，加入2%的胎牛血清，4℃避光保存，即为P1病毒。

4 杆状病毒的扩大培养4.1 在转染当天，准备sf9细胞，铺在6孔板中，每孔铺2×106个细胞，室温培养1hr。

4.2倒置显微镜观察细胞，确认是否已经贴壁。

4.3 加入适当量的P1病毒。

加入量计算方法为：转入病毒的量=MOI（pfu/cell）×细胞数量/病毒滴度（pfu/ml）P1病毒的滴度的范围在1×106---1×107 pfu/ml，MOI一般取0.05-0.1。

4.4 27℃，5%CO2培养箱中培养48hr。

4.5 48hr后，（视杆状病毒的构建情况，决定收集时间）收集病毒于15ml snap-cap管中。

4.6 500g离心5min。

4.7 将上清收集于新的15ml snap-cap管中，即为P2病毒。

4.8 4℃，避光保存。

5 杆状病毒滴度的测定5.1 4%低熔点琼脂糖培养基的配制5.1.1 微波炉加热或者70℃水浴,溶化4%低熔点琼脂。

当低熔点琼脂溶化后，将下列物品放入水浴中：空的100ml无菌瓶Sf-900(1.3×)培养基5.1.2 待低熔点琼脂溶化后，马上将低熔点琼脂、无菌瓶及Sf-900(1.3×)培养基放入超净台。

5.1.3 将30ml Sf-900(1.3×)培养基及10ml 4%低熔点琼脂放入100ml无菌瓶中，温和混匀。

5.1.4 准备好后，于40℃保存。

5.2 蚀斑试验5.2.1在转染当天，收获sf9细胞，并准备30ml细胞悬液，调整细胞密度为5×105/ml，于6孔板中每孔铺2ml细胞。

5.2.2 室温放置1hr，让细胞贴壁。

5.2.3 1hr后，用倒置显微镜观察细胞贴壁的状态，应该有50%细胞贴壁。

5.2.4 在sf-900II SFM中将病毒稀释8个浓度梯度（10-1—10-8）。

取0.5ml病毒放入4.5ml培养基中，稀释为10-1，然后从10-1浓度的病毒中取0.5ml病毒放入4.5ml培养基中，稀释为10-2，依此类推。

5.2.5 将6孔板中的培养基移去，马上加入1ml病毒稀释液。

5.2.6 培养1hr后，马上将放在40℃水浴的平板培养基放入超净台。

5.2.7 将病毒液取出，马上将2ml的平板培养基放入。

（动作要快，以免培养基凝固）。

5.2.8 室温放置10-20min。

5.2.9 将培养基放于27℃，5%CO2培养箱中培养。

5.2.10 在转染第四天时，用sf-900II SFM培养基配制1mg/ml的中性红溶液，抽滤除菌。

5.2.11 将1.5ml的1mg/ml的中性红溶液加入16.5ml的sf-900II SFM培养基中配制中性红溶液，混匀，然后放入40℃水浴中。

5.2.12 将4%的低熔点琼脂溶解，放入40℃水浴中，5min。

5.2.13取6ml 4%的低熔点琼脂加入中性红溶液中，40℃水浴保存。

5.2.14 迅速将配好的低熔点琼脂中性红溶液，按每孔1ml，加入6孔平板培养基中。

5.2.15 待凝固后，于27℃，5%CO2培养箱中继续培养3-6天。

5.2.16 在转染后第7-10天时，用细胞培养级别的水配制1mg/ml的中性红溶液2。

5.2.17 每孔加入0.5ml的1mg/ml的中性红溶液2，室温培养1-2hr。

5.2.18 小心用移液器取出多余的染液，计数。

5.3 病毒滴度的计算方法选择蚀斑数在3-20个的孔，病毒滴度的计算公式为：滴度（pfu/ml）=每孔蚀斑数×稀释倍数×1/ml接种量一般情况下，从杆状病毒中获得的病毒滴度为：P1：1×106----1×107P2：1×107----1×108如果得到的P1＜1×106或P2＜1×107，需要重新构建保种。

6 杆状病毒的纯化6.1用弯头吸管吸出一个清晰的蚀斑，放入1.5ml的灭菌管中，加入500μL sf-900II SFM完全培养基，漩涡混匀。

6.2 加入100μL的agarose plug solution，混匀。

6.3 27℃，5%CO2培养箱中培养72hr。

6.4 用15ml snap-cap管收集培养基，约2ml。

6.5 500×g离心5min。

6.6 将上清转移到一新的15ml snap-cap管中，4℃避光保存。

7蛋白的表达7.1 在24孔板中接6×105 cells/well，贴壁至少30min。

7.2 30min后，移去培养基，马上用新鲜的生长培养基清洗，加入300μL的新鲜培养基。

7.3 加入不同MOI的病毒（1，2，5，10，20）。

7.4 27℃，5%CO2培养箱中培养。

在不同的时间收集细胞（24hr,48hr,72hr,96hr）。

7.5 预冷的PBS(pH7.4)缓冲液洗涤细胞数次。

除尽残留液体，再加入500μL预冷的细胞裂解液(含有1×Protease inhibitor cocktail)，用橡皮刮刮下细胞收集至eppendorf管内，置冰浴裂解45min，每50μL细胞裂解物分装至一个eppendorf管中，置于-20℃或者-80℃贮存备用或直接用于表达情况分析。

重组病毒中和抗体滴定（改良法）分离被检血清，56℃灭活30 min 后，在96 孔细胞培养板中将血清作连续倍比稀释，从1∶2 至1∶256，每个稀释度作4 个重复，每孔50.0μL；用DMEM 将测好TCID50 的PRRSV 稀释为200 TCID50，并加入终浓度为20%的新鲜猪血清，然后将其加入所有加有被检血清的培养孔中，每孔50.0μL，37℃ 5 % CO2 培养箱中作用1 h，再于每孔中滴加2~5×105个/mL 的Marc-145 细胞悬液100.0 μL，轻轻摇匀后，放回培养箱中继续培养4~6 d，观察细胞病变情况，按Reed-Muench 两氏法计算被检血清中抗PRRSV 的特异性中和抗体的滴度。