神经科论文神经内科医学论文神经内科论文：脑缺血恢复期骨髓间充质干细胞移植对神经功能和促血管生成素-1、2及其受体表达的影响【摘要】目的探讨脑缺血恢复期骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对神经功能和促血管生成素(Ang)-1、Ang-2及酪氨酸激酶受体-2(Tie-2)表达的影响。
方法42只SD大鼠随机分为脑缺血对照组(对照组，12只)、BMSC移植组(15只)及假手术组(15只)，各组又分为缺血后28 d、35 d、42 d 3个亚组。
用线栓法制作脑缺血大鼠模型，用改良黏附物移除试验(MST)评估大鼠神经功能。
在脑缺血后21 d，给BMSCs 移植组大鼠尾静脉注射BMSCs，对照组大鼠注射等体积PBS。
在脑缺血后28 d、35 d、42 d(移植后7 d、14 d、21 d)，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western Blotting法检测大鼠缺血周围脑组织Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA和蛋白的水平。
结果BMSCs移植组大鼠各时间点亚组的MST评分均显著高于对照组(均P＜0.05);BM-SCs移植组及对照组各时间点亚组脑组织的Ang-1、Tie-2 mRNA和蛋白水平明显高于假手术组(P＜0．05～0.01)，脑缺血后28 d、35 d，BMSCs 移植组脑组织Ang-1、Tie-2 mRNA及蛋白水平均明显高于对照组(均P＜0.01)，而脑缺血后42 d两组之间的差异无统计学意义;3组各时间点亚组脑组织Ang-2 mRNA及蛋白水平的差异均无统计学意义。
结论脑缺血恢复期BMSCs移植能改善神经功能，并使缺血周围脑组织Ang-1、Tie-2的表达水平明显增高，而对Ang-2表达无明显影响。
【关键词】骨髓间充质干细胞;脑缺血;促血管生成素-1;促血管生成素-2;酪氨酸激酶受体-2促血管生成素(Ang)-1、Ang-2及酪氨酸激酶受体-2(Tie-2)是介导脑缺血后血管源性水肿、血管生成和血管成熟稳定的关键因子。
有研究［1］报道，在脑缺血急性期移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)能使缺血周围脑组织的Ang-1、Tie-2表达上调，减少血-脑屏障的破坏而减轻血管源性脑水肿。
由于条件限制及其他原因使大多数患者难以在脑梗死急性期得到BMSCs移植治疗;有关脑梗死恢复期BMSCs移植治疗的报道很少。
为探讨脑梗死恢复期BMSCs移植治疗的效果及其机制，本研究在大鼠脑缺血恢复期进行BMSCs移植治疗，观察其对神经功能和脑缺血周围组织Ang-1、Ang-2和Tie-2表达的影响。
1材料与方法1．1材料1．1．1动物及分组SPF级健康雄性SD大鼠42只，质量250～280 g，由南京医科大学实验动物中心提供并于该中心屏障系统实验室饲养，自由喂食。
动物分为脑缺血对照组(对照组，12只)、BMSC移植组(15只)、假手术组(15只)，各组又分为缺血后28 d、35 d、42 d 3个亚组。
1．1．2试剂与仪器低糖DMEM培养基(L-DMEM)、胎牛血清、0．25%胰蛋白酶(GIBCO公司)，Trizol(Invitrogen 公司)，RT试剂盒、Taq聚合酶、DNAMarker(Takara公司)，兔抗大鼠Ang-1、Ang-2 IgG多克隆抗体(博奥森公司)，兔抗大鼠Tie-2 IgG多克隆抗体(Santacrus公司)，兔抗大鼠β-actin IgG单克隆抗体(博士德公司);二氧化碳恒温培养箱(Heraeus 公司)，倒置显微镜(OL YMPUS公司)，分光光度计(Amersham Bioscience公司)，PCR仪(Eppendorf公司)，电泳仪、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。
1．2方法1．2．1大鼠脑缺血模型制作大鼠术前禁食6 h，参照Longa等［2］线栓法制作右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)脑缺血模型，缺血90 min后，拔除线栓，术中和术后使动物肛温保持在37℃。
假手术组大鼠除不插入线栓外其他操作相同。
在大鼠缺血24 h时进行Longa 5级4分法评分，取1～3分大鼠入组。
1．2．2 BMSC的分离培养及移植将1只6周龄雄性SD 大鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下取股骨，参照Zacharek等［1］方法进行BMSCs的原代培养及传代，取4～6代的细胞用于移植。
BMSC移植组大鼠在脑缺血21 d后，通过尾静脉注射 1 ml BMSCs悬液(约含2×106个BMSCs)，对照组大鼠同时尾静脉注入1 ml PBS，假手术组不进行注射。
1．2．3神经功能评定各组大鼠在脑缺血后第21 d、24 d、28 d、35 d和42 d用改良黏附物移除试验(MST)［3］评定神经功能。
用一条医用胶带缠绕在大鼠的左前爪(无力侧)，形成一个袖套样胶圈，将大鼠移到笼中观察30 s，记录大鼠用嘴或对侧前爪撕扯试图移除胶圈的时间;每天测试3次并取最短的两次计算平均值，MST评分=大鼠试图移除胶圈的时间与30 s的比值［试图移除胶圈时间(s)÷30 s×100%］。
1．2．4脑组织Ang-1、Ang-2、Tie-2 mRNA检测在各亚组相应时间点将大鼠用颈椎脱臼法处死，对照组、BMSC 移植组大鼠参照文献［4］采用组间等位定位法选取缺血周围脑组织，假手术组大鼠选取右侧皮质脑组织。
用Trizol法提取总mRNA，分光光度计测定吸光度A260及A280，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，参照文献［5］及自行使用Prime 5．0设计引物，由上海英俊生物技术有限公司合成。
引物序列、退火温度、循环数、产物片段长度及退火温度、循环数，见表1。
取10μl PCR产物加样于1．5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像，Image J软件分析，以目的条带与β-actin条带光密度值的比值表示被检测物的mRNA水平。
1．2．5脑组织Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白检测用Western Bolotting法检测，取脑组织40 mg提取总蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将蛋白转上PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭 2 h，分别加入兔抗大鼠Ang-1、Ang-2、Tie-2 IgG多克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST清洗后加入山羊抗兔IgG-HRP，室温孵育1 h。
将膜置于发光液孵育，X线胶片曝光显影。
显影后用Strip溶液将膜洗脱，重新在4℃条件下使用兔抗大鼠β-actin IgG单克隆抗体孵育过夜、二抗孵育、曝光显影。
条带用Labscan系统扫描分析，以目的条带的相对灰度值表示其水平。
1．2．6统计学方法检测数据以均数±标准差(x珋±s)表示，两样本均数间比较采用成组t检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析。
用SPSS 13．0软件进行统计学处理。
2结果2．1各组大鼠MST评分比较见表2。
与假手术组比较，对照组和BMSC移植组各时间点亚组MST评分均明显降低，差异有统计学意义(均P＜0.01)。
脑缺血21 d时，对照组与BMSC移植组MST评分的差异无统计学意义;BMSCs 移植组大鼠自脑缺血24 d开始(移植后)的各时间点亚组MST 评分均明显高于对照组，差异有统计学意义(均P＜0.05)。
2．2各组大鼠缺血周围脑组织Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA 水平比较见表3、表4。
对照组、BMSCs移植组各时间点亚组脑组织Ang-1、Tie-2 mRNA水平均显著高于假手术组(P＜0.05～0．01);BMSCs移植组脑缺血28 d、35 d(移植后7 d、14 d)两个亚组Ang-1、Tie-2 mRNA水平均较对照组显著增高(均P＜0.01)，两组42 d亚组间差异无统计学意义;3组各时间点亚组间脑组织Ang-2 mRNA水平的差异无统计学意义。
2．3各组大鼠缺血周围脑组织Ang-1、Ang-2和Tie-2蛋白水平比较见表5、表6。
BMSCs移植组、对照组各时间点亚组脑组织Ang-1、Tie-2蛋白水平均显著高于假手术组(P ＜0.05～0．01)，BMSCs移植组脑缺血28 d、35 d(移植后7 d、14 d)两亚组脑组织Ang-1、Tie-2蛋白水平均较对照组显著增高，差异有统计学意义(均P＜0.01)，两组脑缺血42 d亚组间差异无统计学意义;3组各时间点亚组之间脑组织Ang-2蛋白水平差异无统计学意义。
3讨论BMSCs是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞，具有多向分化潜能，在一定条件下能向3个胚层的多种细胞分化，包括来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等;由于其取材方便，可自体移植避免伦理问题及免疫排斥反应而成为干细胞移植治疗脑梗死临床试验的合适细胞来源，具有较好的安全性，并能减轻因缺血周边区域脑萎缩而造成的侧脑室扩张［6，7］。
本研究发现，在脑缺血恢复期移植BMSCs能改善脑缺血大鼠的神经功能，在移植后第3 d、7 d、14 d和21 d，BMSCs移植组大鼠的MST评分均明显高于对照组，与Shen等［8］在脑缺血后1个月BMSCs静脉移植的实验结果相似，其发现在移植后1周至12周内，BMSCs移植能改善大鼠的改良神经功能缺损程度评分及MST评分。
脑缺血恢复期时缺血周边区随病程改变由急性期的血-脑屏障破坏、血管源性水肿逐渐转变为血管生成、侧支循环形成，其中Ang及其受体Tie-2在这些过程中起重要作用。
血管生成包括血管内皮细胞的新生、迁移，微血管形成，血管分叉和吻合等过程，血管旁细胞分泌的Ang-1与血管内皮细胞上的受体结合，激活磷酸酰肌醇-3-激酶(PI3K/Akt)通路使内皮细胞活化，从而吸引血管周围细胞环绕、支持内皮细胞形成完整的血管壁，促进血管成熟与稳定。
在Ang-1存在的条件下，Ang-2剂量依赖地拮抗Ang-1对血管内皮Tie-2受体的活化作用，而单一的Ang-2有较弱的激活Tie-2受体作用［9］。
Zhang等［10］的研究显示缺血再灌注损伤后的Ang-1、2/Tie-2表达是一个动态变化的过程，脑缺血后2～28 d缺血周围脑组织Ang-1、Tie-2的表达水平较对侧非缺血区增高，而Ang-2的表达水平从脑缺血后1～14 d升高，28 d 后下降。
研究［11］显示，脑缺血后静脉移植的BMSCs主要迁移至缺血侧大脑半球的缺血灶周围、纹状体等处，在移植的早期(7 d内)主要分布于血管周围，随后迁移至皮质运动区。
急性期移植BMSCs能使缺血周围脑组织的Ang-1、Tie-2表达上调，减少血-脑屏障的破坏而减轻血管源性水肿［1］。
而脑缺血后的血管生成与重塑是一个动态的过程，故本研究选择脑缺血后21 d为BMSCs移植时间点，同时测定缺血周围脑组织Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA和蛋白的表达水平。