经验交流文章编号１００６－８１４７（２０11）０4-0458-03人骨髓间充质干细胞体外培养模型的建立和表型分析刘长乐1，李广平1，郑心田1，孟恒星2，邱录贵2，娄建石3（1.天津医科大学第二医院心脏科，天津300211；2.中国协和医科大学血液病学研究所，天津300020；3.天津医科大学药理学教研室，天津300070）关键词骨髓间充质干细胞；流式细胞术；培养模型中图分类号Q813文献标识码B骨髓（bone marrow ，BM ）中包含有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)。
MSCs 属混杂细胞群，其表面抗原标志尚未完全确定。
MSCs 作为多能干细胞具有可塑性，有报道显示在细胞因子作用下可以在体外诱导分化为骨骼肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、上皮细胞和血管内皮细胞，并且参与体内组织新生、损伤修复和重建[1]。
本实验应用改进的密度梯度离心法、差异贴壁法和酶消化法建立MSCs 的体外培养扩增模型，寻找高度特异性的表面抗原，以利于干细胞移植的广泛应用。
1材料与方法1.1材料（1）BM ：39岁男性健康志愿者5mL 。
（2）仪器：FACScar 流式细胞仪（Beckman -Coulter ），倒置相差显微镜（OLYMPUS ），荧光显微镜（OLYM －PUS ），恒温培养箱（Forma Scientific ），高速低温离心胞系MHCC97-H 的增殖。
骨髓间充质干细胞旁分泌物质或许通过分泌细胞因子影响肝癌细胞某一信号通路促进细胞增殖的。
AFP 是CBRH-7919肝癌细胞分泌的一种蛋白，本研究发现随着骨髓间充质干细胞旁分泌物质浓度的升高，AFP 也逐渐升高，表明骨髓间充质干细胞旁分泌物质也增强了7919肝癌细胞分泌AFP 的功能。
骨髓间充质干细胞促进肝癌细胞增殖的具体机制目前尚未明确，目前有以下几种学说：免疫抑制影响肿瘤基因的表达，分泌细胞因子以及参与肿瘤血管形成等[4-7]。
邵志红等[5]发现大鼠骨髓间充质干细胞能通过影响Walker-256肝癌细胞VEGF 和nm23的表达,促进肝癌细胞的增殖。
Li 等[6]发现人骨髓间充质干细胞是通过分泌细胞因子进而影响TGFβ信号通路促进肝癌细胞增殖的。
尽管骨髓间充质干细胞对肝癌增殖的确切机制尚未明确，但有效地抑制骨髓间充质干细胞的促增殖作用具有重要的意义，其有可能成为新的抗癌靶点。
笔者将继续研究骨髓间充质干细胞旁分泌物质促进肝癌细胞增殖的内在机制，为肝癌治疗带来新的希望。
参考文献：［1］Lu YR,Yuan Y,Wang XJ,et al.The growth inhibitory effect ofmesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo[J].Can-cer Biol Ther,2008,7(2):245［2］乔玲，赵铁军，山长亮，等.人间充质干细胞抑制肝癌细胞增殖的作用及其基因表达谱分析[J].中国生物化学与分子生物学报，2007，23(12):1037［3］陈双庆，王培军，李铭华，等.磁标记骨髓间充质干细胞对肝细胞癌的抑制作用[J].临床放射学杂志，2009，28(10):1454［4］Djouad F,Plence P,Bony C,et al.Immunosuppressive effect ofmesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals [J].Blood，2003,102(10):3837［5］邵志红，王培军，李铭华，等.大鼠骨髓间充质干细胞移植对Walker-256肝癌生长影响的实验研究[J].中华医学杂志，2009，89(7):491［6］Li GC,Ye QH,Xue YH,et al.Human mesenchymal stem cells in-hibit metastasis of a hepatocel lular carcinoma model using the MHCC97-H cell line [J].Cancer Sci,2010,101(12):2546［7］Zhu W,Xu W,Jiang R,et al.Mesenchymal stem cells derived frombone marrow favor tumor cell growth in vivo [J].Exp Mol Pathol,2006,80(3):267［8］Zheng JF,Liang LJ.Transplanted bone marrow stromal cells are notcellular origin of hepatocellular carcinomas in a mouse model of carcinogenesis[J].World J Gastroenterol,2008,14(19):3015［9］Leek RD,Harris AL,Lewis CE.Cytokine networks in solid humantumors:regulation of angiogenesis[J].J Leukoc Biol,1994,56(4):423［10］Budhu A,Wang XW.The role of cytokines in hepatocellular carci-noma[J].J Leukoc Biol,2006,80(6):1197（2011-04-27收稿）作者简介刘长乐（1979-），男，主治医师，硕士，研究方向：冠心病、心律失常；通信作者：李广平，Email ：tjcardiol@ 。
Ｖｏｌ．１7熏Ｎｏ．4Dec.２０11天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第１7卷4期２０11年12月458图3MSCs （HE ，×400）图1原代MSCs （×100）图2传代MSCs （×100）机（Beckman-Coulter ），细胞计数仪KX21型（SYS －MEX ）。
（3）试剂和材料：人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品公司）、DMEM/F12+MCDB 培养基（In －vitrogen ），FCS （hyclon ），IGF （pepro tech ），bFGF （pe －pro tech ），EGF （pepro tech ），CD34IgG （Coulter ），KDR IgG （R&D Systems ），CD44FITC （Genevale ），CD45FITC （Coulter ），CD54FITC （B&D ），CD73PE（B&D ），CD90FITC （B&D ），CD105PE （Laborato －ries ），CD106PE （Biole gend ），IgG-FITC /PE（B&D ）。
1.2方法1.2.1MSCs 的原代培养抽取BM 液5mL ，肝素抗凝。
DMEM+F12培养液稀释后，用人淋巴细胞分离液Ficoll （比重为1.077）密度梯度离心法，分离出单个核细胞。
用DMEM+F12洗涤后，加入DMEM+F12与MCBD 的混合培养液，并加入10%胎牛血清（FCS ）、2ng/mL bFGF 、10ng/mL EGF 、10ng/mL IGF 。
24h 后弃去未贴壁细胞，贴壁细胞继续培养，每4d半量换液，倒置相差显微镜每天观察生长情况，苏木-伊红（HE ）染色观察摄片。
1.2.2MSCs 的传代培养生长12d 后近融合时，用2mL 0.25%的胰蛋白酶+0.02%EDTA 的消化液消化，以1:2～1:3传代。
每天观察生长情况。
1.2.3表面抗原检测收集培养细胞，取1×104个细胞用PBS 调整到100μL ，经多聚甲醛固定后用流式细胞分析仪检测CD34、CD45、CD54、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和KDR 阳性表达百分比。
2结果2.1倒置相差显微镜下直接观察细胞形态从BM 液中分离出的单个核细胞培养24h 后，可见散在贴壁细胞，并伸展为长梭形或多角形，即为原代MSCs （P0）。
细胞呈克隆样成簇生长，初始细胞形态及大小不一。
原代MSCs 培养14d ，克隆生长细胞见有90%融合。
第4代细胞形态渐趋均一化，生长速度快且倍增稳定。
见图1、2。
2.2HE 染色胞核呈蓝色、卵圆形，大而不规则，可见核仁，胞浆呈粉红色，胞质均匀，胞膜较清楚。
见图3。
2.3MSCs 表面抗原表达流式细胞仪检测结果显示:CD44++、CD73++、CD90++、CD105++；CD54+、CD106+、CD34-、CD45-、KDR-。
具体数值见图4。
第4期刘长乐，等.人骨髓间充质干细胞体外培养模型的建立和表型分析459图4MSCs 表面抗原表达（%）3讨论目前研究MSCs 的生物学特性和增殖特点的关键是利用一种方法获得更为纯净、单一的MSCs 。
密度梯度离心是目前应用最多的方法，本实验结合自然贴壁法、酶消化法分离获得的细胞较多，而且增殖速度较快。
BM 单个核细胞接种24h 后有少量细胞贴壁，贴壁后分裂增殖逐渐伸展成梭形或多角形，贴壁第5天呈克隆样簇状生长，细胞数量扩增，生长速度加快。
经传代培养扩增至第4代，细胞形态较为均一，生长倍增稳定。
目前鉴定MSCs 的表面标记物具有非专一性和种属特异性，MSCs 可以表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，以及多种细胞因子、粘附分子和生长因子的受体[1]。
人MSCs 与造血干细胞共同存在于BM 中，但MSCs 不表达典型造血细胞表面抗原，如造血干细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45、单核/巨噬细胞表面抗原CD14等[2]。
MSCs 只表达CD29、CD44、CD90、CD105、CD166等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志[3]。
还有报道CD105+、CD73+、CD90+和CD45-、CD34-、CD14-这一细胞群代表MSCs [4]。
本实验中CD34在MSCs 中表达量极小，说明不表达造血细胞的表面标志。
CD45是泛白细胞标志物，又称白细胞共同抗原，有研究报道在用单克隆抗体磁珠分选MSCs 组分时，发现CD45在MSCs 有低水平的表达，但在人工培养下，很快即失去表达阳性[4]。
本实验第4代MSCs 显示CD45为阴性表达，与文献报道一致。
血管内皮细胞生长因子受体2（kinase-insert domain contein ing receptor ，KDR ），主要表达在血管内皮细胞及胚胎内皮的前体细胞上。