层析包括吸附层析分配层析离 子交换层析亲和层析等详解演
示文稿
优选层析包括吸附层析分配层 析离子交换层析亲和层析等
2、层析法是目前广泛应用的一种分离技术， 是分离各种生物大分子的主要手段之一，是 利用不同物质理化性质的差异而建立起来的 技术。
3、40年代：两位英国科学家Martin和 Synge发明了分配色谱（层析），他们首先 提出了色谱塔板理论，获得了1952年的诺 贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化 物质的关键技术。
6、在层析法实验技术有凝胶层析法、离子交换层析 法、高效液相层析法、亲和层析法、聚焦层析法等
二、原理及概念
层析技术是一类物理分 离方法,根据待分离混合 物中各组分物理化学性 质的差别,使各组分以不 同程度分布在固定相和 流动相两相中,由于各组 分随流动相前进的速度 不同,从而得到有效分离。
例如：我们利用物质在溶解度、吸附能 力、立体化学特性及分子的大小、带电 情况及离子交换、亲和力的大小及特异 的生物学反应等方面的差异，使其在流 动相与固定相之间的分配系数（或称分 配常数）不同，达到彼此分离的目的。
分配系数与迁移率的关系
❖ K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小； 反之则结合力小，迁移率大
❖ K增加，Rf减少；反之，会减少，Rf增加
❖ 不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数 或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能 否分 离的先决条件。其差异越大，分离效果越理想。
操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达 到平衡时，存在于基质上的饱和容量。每克（或毫 升）基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）。 数值大，结合力强。
亲和层析法
分离原理
组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附 剂，各能力不同 各组份在流动相和静止液相（固相）中的 分配系数不同 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换 剂亲和力不同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
固定相只能与一种待分离组份专一结合， 以此和无亲和力的其它组份分离
层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体 物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相， 即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时， 由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用 （吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配 （含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份， 随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。 反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越 慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份， 从而达到将各组份分离的目的。
凝胶层析
（gel chromatography）
凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography） 分子筛层析（molecular sieve chromatography） 凝胶过滤（gel filtration） 凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）
分配系数（distribution coefficient）
分配系数是指在一定的条件下（如温度、压力）， 某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比 值，分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据， 常用K来表示
K cs cm
Cs: 溶质在固定相中的浓度，Cm:溶质在流动相中的浓度
❖ K值大表示其溶质在固定相中浓度大， 在洗脱过程中溶质出现较晚
4、按照不同的标准层析法有不同的分类。 根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定 性及定量。层析法与光学、电学或电化学 仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度 或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化， 大大缩短分析时间。
5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、 速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样 品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来， 已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医 药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也 得到了广泛的应用。
❖ K值小表示某溶质在流动相中浓度 大，故在洗脱液中出现较早
❖ 有相似的K值，则表明两组分层析峰 会发生重叠，分离效果差
分配系数主要与下列因素有关： ①被分离物质本身的性质 ②固定相和流动相的性质 ③层析柱的温度。
不同的层析机理，其K值函义不同:
❖ 吸附层析中K值表示吸附平衡常数 ❖ 分配层析中K值表示分配系数 ❖ 离子交换层析中K表示交换常数 ❖ 亲和层析中K表示亲和常数。
膨胀度（Vβ)： 在一定溶液中，单位重量的基质充 分溶胀后所占有的体积；即每克溶胀基质所具有的 床体积。
床体积（Vt)
三、分类
1、按两相所处状态分类
流动相
液体
气体
固定 相
液体 液-液层析 法
固体 液-固层析 法
气-液层析 法
气-固层析 法
2、按层析原理分类
名称 吸附层析法 分配层析法 离子交换层析法 凝胶层析法
基本概念
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物 质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液 体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基 质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换 等作用。
流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质 朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。 柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
3、按操作形式不同分类柱层来自法名称薄层层析法
纸层析法 薄膜层析法
操作形式
固定相装于柱内，使样品沿着一个 方向前移而达分离
将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄 板上，点样后用流动相展开，使各 组份分离
用滤纸作液体的载体，点样后用流 动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成薄 膜，以类似纸层析方法进行物质的 分离
迁移率
迁移率（ Rf或比移值）是指：在一定条件下， 在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与 流动相本身移动的距离之比值 。常用Rf来表示
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率 是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在 固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移 动的距离之比 值。常用Rx来表示