Testsolution: 1% acetone (about 0.5% of column volume), 0.2 AUFS at 280 nm. Alternatively use 2 M NaCl and conductivity monitor.
Efficiency
Efficiency depends on:
Maximum number of peaks in RPC > 150
0
10
6 5
7
20 ml
0.04
0.02 V0 0 0 5 10 15 20 25 Vt
0
200
400
ml
Remember: we are not purifying peaks, but proteins & peptides !
Resolution Efficiency Selectivity Symmetry
Resolution: the power to separate peaks
Maximum number of peaks in gel filtration ca 15
0.12 4 0.10 2 0.08 1 0.06 3
样品稳定性
离心后，测量 280 吸收和活性 pH：pH 2 - 9 (1 pH 间隔) 盐：0-4 M 氯化钠，0-2 M 硫酸氨 (0.5 M 间隔) 有机溶剂：0 - 50 % 乙腈，乙醇,甲醇 (10 % 间隔) 温度：4 - 40 摄氏度 (10 度 间隔) 时间：室温保存 (1 小时间隔)
High selectivity Lower selectivity
Selectivity: Selectivity
Is a measure of peak separation High selectivity gives baseline separations If selectivity is high, low efficiency can be tolerated (if large peak volume is acceptable).
Complementary to ion exchange (IEX) and gel filtration (GF) Mild, non-denaturing High selectivity High recovery Concentrating technique
Why use affinity chromatography ?
准备工作
考虑: 考虑
纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济
蛋白质特性: 蛋白质特性
稳定性
- pH - 离子强度 - 温度
分子量 等电点
样品准备
考虑: 考虑
根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理 用缓冲液维持 pH, 离子强度 目的: 目的 稳定样品
Efficiency: the quality of your column 2 V N = 5.54 ( W r )
h
AU280
N = Number of theoretical plates
Wh = Peak width at half peak height
HETP = L/N
Vr
HETP = Height equivalent of theoretical plates L = Length of packed column bed
提高回收率方法
定期进行在位清洗 在样品稳定限制下保存和工作 尽量减少步骤 探索可接受分辨率下最大回收率的工艺 添加 EDTA 或二硫苏糖醇 用非目标蛋白洗柱使非特异性吸附位点饱和 使用防氧化剂避免氧化，尤其在高 pH 下 转用技术相似填料 转用回收率可接受的其他技术
选择层析方法
若对目标蛋白或样品不大了解，可尝试以下方法： 用分离范围宽广的凝胶过滤介质如Superose, Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白， 一步 即可得到高纯度样品；亦可用各种活化偶联介质 偶联目标 蛋白的底物、受体等自制亲和介质 体积大的样品，往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯 化； 高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化 疏水层析用高盐吸附，低盐洗脱的原理，洗脱的样品 又可 直接上离子交换介质；两种方法常被交替使用
Particle size of matrix Particle size distribution of matrix Packing quality of the column Sample (volume and viscosity) Flow rate
Why use gel filtration?
Why use ion exchange?
Useful at all stages of purification and at all scales Controllable High selectivity High capacity Concentratinghobic interaction ?
Pros Fastest for buffer exchange Very gentle, high yields Works in any buffer solution Removes dimers and aggregates Separates by size Cons Limited sample volume Poor selectivity compared with SDS-PAGE
Why use reversed phase ?
RPC gives the highest resolution Simple eluents: water and organic solvents Easy manipulation of resolution by changing parameters Removing specific contaminants Unfortunately denaturing for larger proteins
Efficiency: Efficiency
High efficiency Low efficiency
Is a measure of peak width High efficiency means sharp peaks High efficiency means a good packed column High efficiency can compensate for low selectivity
The three stages in downstream processing
层析工艺的建立
为何选择层析作为生物分子纯化方法？
不产生热 不产生外力 高回收率 高分辨率 线性放大，可预期 可自动化 大量成功例子
专门分离和纯化各类生物分子
•天然蛋白质 •重组和融合蛋白质 •肽类 •寡核苷酸 •质粒 •病毒 •抗生素 •生物碱 •。。。。。。等等
18
在AKTAprime 上用 HiTrap Desalting 柱脱盐
层析基本原理及工艺的建立
Chromatography Techniques
In order to purify proteins, peptides and nucleic acids we need powerful techniques.
Content
Principles of Operation Terms & Parameters Advantages & Disadvantages of different techniques Optimization of separation techniques
• 如 可 跟 目 标 分 子 兼 容 ： 可 选 择 有 机 溶 剂 • 添 加 硫 酸 链 霉 素 ， 或 锰 盐 沉 淀 核 酸 • 添 加 核 酸 酶 硫 酸 精 蛋 白
蛋 白 酶
分 解 目 标 分 子
• 添 加 蛋 白 酶 抑 制 剂 • 用 亲 和 层 析 去 处 蛋 白 酶 • 缩 短 粗 分 离 时 间 • 低 温 操 作 •
Figure: Purification of IgY from egg yolk after water extraction of lipids on HiTrap IgY Purification.
抗生素高分子杂质检测
Alkaloid Scale up on SP SrHP
Active component
Resolution factor Rs
Rs = 0.6
Resolution =
Rs = 1
Peak separation Peak width at ½ height
Rs = 4
Vr 2 − Vr 1 Rs = (W 1 + W 2 ) 2
Resolution: depends on efficiency and selectivity
样品预处理
污 染 物 絮 状 物 害 处 堵 柱 预 防 措 施 • 以 0.22 0.45 10000 µm g 滤 膜 过 滤 10 15 分 • 高 速 离 心 钟 • 细 胞 匀 浆 ： 离 心 500000g 脂 类 • 阻 断 配 基 作 用 • 引 致 凝 集 • 引 起 非 特 异 性 吸 附 核 酸 • 阻 断 配 基 作 用 • 高 黏 度 • 离 心 10000 g 10 15 分 钟 40000 -
Direct scale up from HiTrap SP to g level in SHMU on AKTA100
开发纯化工艺的注意点
建立检测方法 纯度和产量) 确立目标 (纯度和产量 纯度和产量 目标蛋白的性质 使用不同原理的纯化方法 减少步骤 尽量减少每步之间样品条件的改变 选用高选择性的方法 - 提高效率 快速去除蛋白水解酶 在早期步骤中缩小样品体积 工艺方法尽量简单! 工艺方法尽量简单