2. 洗脱法
样品经色谱分离后，用适当方法定出色点或色带位置，然后 将色点部位的吸附剂取下，用溶剂将化合物洗脱萃取后进行测定。
3. 薄层扫描法
用仪器来测定每个斑点或谱带的含量，则更方便和客观，误 差在5％以下。
类别 薄层
几类化合物的薄层色谱
展开剂
显色剂
生物碱 甾体
氨基酸 酚类
氧化铝 硅胶 氧化铝 硅胶
氧化铝 硅胶 硅胶
1）氯仿+5-15%甲醇 2）苯+1-10%乙醇等
1）环己烷：乙酸乙酯=7：3 2）氯仿：丙酮=9：1 3）甲酸：乙酸：水=5：5：1
1）正丁醇+50%乙醇 2）甲醇：乙酸=97：3
1）苯 2）环己烷：氯仿：二乙胺=5：5：1
1）改良的碘化铋钾试剂 2）碘蒸气 1）5%磷钼酸 2）三氯化锑-氯仿溶液
用单一溶剂为展开剂时，由于溶剂组分简单，分离重现性好，对 于难分离的化合物经常要用二元、三元甚至多元溶剂组成的展开剂。 在混合展开剂中占比例大的主要溶剂起溶解物质和基本分离的作用， 比例较小的溶剂起调整改善分离物质的Rf值及对某些物质的选择作用。 一般主要溶剂选用不易形成氢键的溶剂，或极性比分离物质低的溶剂， 否则将使被分离物质的Rf值太大或甚至跟随溶剂前缘移动。
二、吸附柱色谱
吸附柱色谱是将待分离混合物样品均匀地加在装有 吸附剂的柱子中，再加适当的溶剂（洗脱剂）冲洗，由 于吸附剂对各组分吸附能力不同，各组分在柱中向下移 动的速度不同，吸附力最弱的组分随溶剂首先流出，通 过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。柱色谱装 置如图示。
混合物中含A、B两个组分，溶解后 加至色谱柱中。开始A和B都被吸附在柱 的上端，形成原始谱带。当加入洗脱剂 冲洗时，A和B将随着向下流动而从吸附 剂上洗脱，接着又遇到吸附剂又被吸附， 又随着向下流动的洗脱剂冲洗而被洗脱， 如此连续不断地被再吸附、再洗脱，经 过一段时间的冲洗后，由于A、B的极性 不同，在该吸附剂和洗脱剂上被吸附和 被洗脱的性能也不同，最终出现A、B两 个色谱带。由于A的吸附力小于B，故A 移行较快，在色谱柱下段，而B移行较慢， 在柱的上段。继续用溶剂冲洗，A、B将 先后被洗脱出来。分别定量收集洗脱液， 用TLC跟踪检验，斑点相同的流分A、B 两个纯品化合物。
预饱和是减少边缘效应 的有效办法！
边缘效应示意图
预饱和：可在加入展开剂后使展开容器密闭， 放置15-30分钟，待溶剂蒸汽平衡后，迅速放入点有 样品的薄层板，立即密闭，展开。必要时可放置适 当大小的滤纸促使展开缸内蒸汽达到饱和。
15－30min 展 开
15－30min 倾倒
展开
常用展开剂
对展开剂的要求 ① 对被测组分有良好的溶解性； ② 有良好的分离效果； ③ 斑点圆整不拖尾； ④ Rf值最好在0.3-0.5，组分较多最好在0.25-0.75； ⑤ 展开剂不能和被测组分发生反应； ⑥ 沸点适中，粘度较小。
展 开 后 的 薄 层 板
（二）定 量
1. 目视比较法
将不同量的标准品作为系列，同样样品分别点在同一薄层上 展开，显色后，目测比较斑点颜色的深浅和面积大小，求出未知 物含量的近似值，作为半定量法，精密度为±10%。 例：硫酸长春碱的纯度检查（中国药典方法）
色谱条件：硅胶GF254制成的薄层板，展开剂为石油醚（30~50℃） －氯仿－丙酮－二乙胺（12:6:1:1）,根据硫酸长春碱结构在紫外灯 （254nm）下检测。
chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，“写”。色谱为 层析的同义语，都是从英语chromatography译来的。
茨维特色谱图 （1906）
叶绿素的石油醚溶液流经
装有CaCO3的柱子，然后 用石油醚淋洗.
CaCO3对叶绿素各成分吸 附能力不同，而分离成为
色带.
叶绿素 叶绿素
叶黄素'， " 叶黄素
薄层色谱和柱层析
色谱法
色谱法是目前最常用的一类分离技术，利用不同结构或不 同性质的物质在不相混溶的二相中分布不同而进行分离。当流 动相流过固定相时，这些物质被流动相带过，以不同速度向前 移动。经过一段时间之后，不同物质移动的距离有较明显的差 异，被分离成一条条的色带，从而可以取下、溶出，获得纯的 组分。
薄层点样
以使用的器具不同，点样可分为手动和自动点样。
•手动点样主要使用的器具有微升毛细管、微量注射 器或配合与之相应的手动点样仪等。
• 自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按 预设程序自动点样。
以点样方式的不同可分为接触式点样和喷雾点样两种。
接触式点样：多采用定量毛细管、微量注射器手动点样， 有的仪器也可进行自动接触式点样。
柱色谱是较经典的有机物分离技术，原理和薄层 色谱相同，但装置有所不同，主要由一个均匀玻璃柱 和填充填料组成，填料是决定柱效的主要因素，填料 必须满足具有不溶于所使用流动相、不使欲分离的样 品破坏或分解、惰性大、可逆性强和吸附容量大。同 时，填料颗粒直径要均匀。最常见的柱色谱是硅胶色 谱、氧化铝色谱、离子交换柱色谱、聚酰胺柱色谱和 凝胶柱色谱。
在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提高 分离度，用粘度太大的溶剂时，需要加入一种溶剂以降低展开剂的粘 度、加快展开速度。
例：环己烷－丙酮－二乙胺－水（10:5:2:5）这个系统中，水是极性 大的溶剂，环己烷是极性小的溶剂，后者的加入可以降低分离物质的 Rf值，丙酮起着混合整个系统及降低展开剂粘度的作用，少量二乙胺 的加入控制了展开剂的pH值以使分离后的斑点不致拖尾，分离清晰。
水合茚三酮溶液
5%三氯化铁溶液
醛类
黄酮类 及其单 糖甙类
纤维素 硅胶 纤维素
1）丁醇：醋酸：水=4：1：5 2）苯：醋酸：水=2：2：1或1：1：2
1）苯：石油醚=1：1 2）苯+5%乙酸乙酯
1）70%醋酸 2）30%醋酸 3）丁醇：醋酸：水=4：1：5
邻联茴香胺乙酸溶液 1%三氯化铝的乙醇溶液
柱色谱法 (Column Chromatograph)
薄层固定相
• 按照固定相的种类，薄层板可分为正相薄层板（如硅 胶薄层板、聚酰胺薄层板）、反相薄层板（如C18键合 相薄层板）等。
• 硅胶薄层板是目前使用最广的薄层板，有硅胶G板、 硅胶GF254板、硅胶H板和硅胶HF254板等规格。
• 高效薄层板（HPTLC，High Performance TLC）所使 用的固定相较普通薄层板平均粒度小，颗粒分布范围窄， 因此在相对短的展开距离中可以达到更好的分离效果。
应用实例：狄戈辛（异羟基洋地黄毒苷）的分离
支持剂：国产层析硅胶80100目，加2/3量的水（以乙酸乙酯饱和），调 匀，再以乙酸乙酯（水饱和）浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直 径与长度比 1:2 以上。
实验方法：取样品与1 2倍量硅胶磨匀，加入柱顶，用水饱和的乙酸乙 酯（含0.5%甲醇）洗脱，分部收集，各流分均作纸色谱及薄层色谱 检查，比移值相同的流分合并，减压蒸干，以甲醇结晶，得到洋地 黄毒苷、羟基洋地黄毒苷、异羟基洋地黄毒苷三种单体。
供试液的溶剂在原点的残留，也会改变展开的选择性。 •极性与展开剂极性相差较大时更为明显； •亲水性溶剂残留在原点吸收大气中的水分（特别在高湿度环 境）对色谱质量的影响也不可低估。
因此点样时，
• 应注意选择适宜的溶剂；
• 同步干燥或上样后继后干燥以除去原点残存的溶剂。尽可能
避免高温加热，以免遇热不稳定的成分的破坏导致样品中某些
接触式点样应注意： 正确选择溶解样品的溶剂 原点直径一般以3mm为宜 防止点样毛细管损伤薄层表面 尽量避免多次点样 防止点样环形色谱效应
点样环形色谱效应： 在点样的同时，样品在原点呈环状展开，如果样品在溶剂 中的溶解度很大，原点将变成空心环，称为“点样环形色 谱效应”。它会对展开造成不良影响。应选择样品组分溶 解度相对较小的溶剂以避免此现象的产生。
• 反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定（液）相，以水或亲水 性溶剂作移动相的分配色谱称为反相分配色谱。当分离脂溶性或 极性较小的成分，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常 用反相分配色谱。实践中有70%以上的分配色谱都采用反相色谱。
分配柱色谱的应用
分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物 碱、苷类、糖类、有机酸、酚类及氨基酸的衍生物；对某些非极性 化合物，如油脂、甾体等物质，可采用反相分配柱色谱法。
显色
1. 有色化合物——直接定位
有荧光斑
2. 无色
紫外吸收 显色剂定位
紫外灯检出 有暗斑
喷雾显色 （喷雾后加热显色） 蒸气熏蒸显色
浸渍显色∶盛有显色剂的展开缸 显色剂：通用有碘、硫酸
① 碘蒸气在浅黄色背景上，很多有机化合物吸附碘，可逆地产生棕色 到黄色斑点，不少化合物的检测灵敏度可达0.5~1μg。
• 分配色谱—样品组分的分配系数不同 • 吸附色谱— 样品组分对固定相表面吸
附力不同 • 体积排阻色谱—利用固定相孔径不同，
把样品组分按分子大小 分开 • 离子交换色谱—不同离子与固定相相
反电荷间的作用力大 小不同
薄层色谱法 (Thin Layer Chromatography)
最常用的薄层色谱也属于液-固吸附色谱。同柱色 谱不同的是吸附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂 层。干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展 开剂的的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细 作用向上移动。与柱色谱过程相同，经过在吸附剂和展开 剂之间的多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成 孤立的样点，实现混合物的分离。
② 10%硫酸乙醇液，喷雾后于105℃加热10~15min，日光或紫外光下 观察。大多数有机物呈有色斑点，如红色、棕色和紫色等，在炭化 以前，不同的化合物将出现一系列颜色的改变，被炭化的化合物常 出现荧光。
③ 高锰酸钾－硫酸液，结果为粉底本色上产生白色斑点。
④ 25%高氯酸水液，喷雾后加热至150 ℃观察。 ⑤ 10％～20％五氯化锑的四氯化碳液，或三氯化锑的乙醇饱和溶液。