(二)特殊方法： 1 ． 细 菌 DNA 鸟 嘌 呤 十 胞 嘧 啶 克 分 子 百 分 比
(C+CMOL％)的测定; 2．布氏菌DNA与可疑菌DNA杂交试验; 3．应用色谱技术鉴定布氏菌;
布氏菌属的种、型鉴定方法
▪ 初代分离培养对二氧化碳的需要 ▪ 硫化氢产生试验 ▪ 染料抑菌试验 ▪ 单项特异性血清A、M、R凝集试验 ▪ 粗糙型（R型）血清凝集试验（玻片、试管法） ▪ 噬菌体裂解试验 ▪ 尿素酶活性试验
生存时间（天） 25—65 21—90 14—47 20—45 60—318 120 死亡 20—50
(1)对物理因子的抵抗力
物理因子对布氏菌的影响
物理因子 湿热56℃ 湿热63℃ 湿热80℃ 湿热90℃ 湿热100℃
生存时间 物理因子 生存时间
60分钟以上 干热80℃ 60分钟以上
60
干热90℃ 60分钟以上
人间布病血清学阳性判定标准
病原分离:检出布鲁氏菌； 试管凝集试验:1:100(++)及以上为阳性； 补体结合试验:1:10 (++)及以上为阳性； 抗人球蛋白试:1:400(++)及以上为阳性；
人间布病诊断方法和判定标准
▪ 凡具备1、2和第3项中的任何一项 检查阳性即可确定为布病病人。
▪ 对已确诊的慢性布病病人和接种过 菌苗的人，应以临床症状为主要依 据，血清学试验效价高低，皮变反 应仅供参考。
皮内变态反应禁忌
▪ 既往有各种过敏史者， ▪ 支气管哮喘病者 ▪ 不可使用
评价：
▪ 此法敏感性较好，呈阳性反应的人只 表示受过布氏菌感染，不能做最后判定。
▪ 此法用于流行病学调查和大量检疫， 所以布病监测时为初诊方法，若皮变阳 性，应采血进一步做特异性抗体检测。
（2）试管凝集试验
原理：
Ag+Ab Nacl电介质 Ag-Ab
二、从牲畜材料中分离布氏菌
从牲畜流产羔检菌： 从胎衣检菌： 从阴道分泌物检菌： 尿液检菌： 乳汁检菌： 脓汁检菌： 血液培养： 脏器检菌：
我国出菌宿主及材料
我国从人、羊、牛、猪、犬、鹿、马、骆驼等家畜及黄 羊、岩羊、黄鼠、黄胸鼠等野生动物检出布氏菌。从牧 区水塘水和羊毛中也检出过布氏菌。
3、培养特性
1.布鲁氏菌培养营养要求高：
需要各种氨基酸和各种金属离子，有的菌种需要 血清才能生长。
2.生长缓慢：一般需经4—6天，有的甚至21—30
天才能长出菌落。
3.生长所需温度：20—40℃，最适为37℃,超过 42℃则不生长。
4. C02: 绵羊附睾种菌和牛种菌的某些生物型菌需严格的 C02(5～10％)。
++++ 等于完全凝集，上层液100%清亮。 +++ 等于几乎完全凝集，上层液75%清亮。 ++ 等于显著凝集，上层液50%清亮。 + 等于有凝集出现，液体25%清亮。 - 等于无凝集，液体不清亮。 人的诊断标准：1:100++为阳性，1:50++为可疑。
评价：试管凝集试验是Wright和Sample于 1898年首先建立的，是布病诊断在国 际上唯一的全标化方法，使用广泛， 经久不衰。特异性好，也较敏感，实 用性强，诊断、流调、监测均适用。
布鲁氏菌的发展史
年份
菌名
发现人
国家
宿主
1887 1897 1914
羊种菌 牛种菌 猪种菌
Bruce
马尔他
羊
Bang
丹麦
牛
Traun
美国
猪
1953
绵羊附睾种菌
Buadle
新西兰
公绵羊
1956 1966
沙漠森林鼠种菌 犬种菌
Stoennen Carmichael
美国 美国
沙漠森林野鼠 小猎犬
（一）病原学概述
对低温和干燥有较强的抵抗力，故可用冷 冻真空干燥法保存菌种。
布氏菌在自然条件下的生存能力
自然条件 水 尘 粪 畜舍墙棚 地面 衣服 皮毛 鲜牛乳
生存时间（天） 50—120 4—120 21—72 4—150 4—150 30—80 45—120 2—550
自然条件 奶油 奶酪 冻肉 腌肉 培养基 干燥胎膜 腐败脏器 人工胃液
3 1分钟以内 甲
0.2
20分钟以上
0.2 5～7分钟 乳 酸 0.5
1分钟以内
0.5 3～5
氢氧化钾 2
3分钟
升 汞 0.05 1分钟以内 肥皂 2
20分钟以上
主要化学药品对三型菌的影响
──────────────────
化学药品名称
浓度 布鲁氏菌生存时间(分钟)
──────────────
(%) 羊型 牛型 猪型
布鲁氏菌属（Brucella) 包括6个种19个生物型。
牛种布氏菌（Br abortus) ： 1、2、3、4、5、6、7、9型 羊种布氏菌（Br melitensis) ：1、2、3型 猪种布氏菌（Br suis) ： 1、2、3、4、5型 沙漠森林野鼠种布氏菌（Br neotomae) 绵羊附睾种布氏菌（Br ovis) 犬种布氏菌 （Br canis)
缺点：
— 有前带现象。
— 不能区别人工免疫和自然感染。
— 产生一定的交叉反应。
— 慢，需要两天。
（3）、虎红平板凝集试验
(一)器材及试剂 清洁脱脂玻片或有凹型孔的玻片，0.1毫升吸 管或微量加样器、牙签或细铁丝。虎红平板 凝集抗原、被检血清。 (二)操作方法 在玻片上加0.03毫升被检血清，然后加入虎 红平板抗原0.03毫升，摇匀或用牙签混匀， 在5分钟内判定结果。判定级别同平板凝集 反应。亦可只分为(+)阳性，(-)阴性两类。
1、形 态
布鲁氏菌是一组微小的球状、球杆状、短 杆状细菌；
宽约0.3—0.5微米、长0.6—1.5微米。电 镜下见到的羊种菌为明显的球杆状、牛种 菌和猪种菌为短杆状；
6种布鲁氏菌靠形态很难区分，一般来说， 羊种菌最小，牛种菌产次之，猪种菌较大；
布鲁氏菌没有鞭毛，不形成芽胞和夹膜。
2、染 色
布氏菌侵入机体后，就会刺激 机体产生特异性抗体，这种抗 体可与相应抗原（布氏菌体） 发生特异性结合，在电介质作 用下，就会形成肉眼可见的凝 集反应，我们就是用已知抗原 查未知抗体。
试管凝集反应步骤 1、加入倍比稀释受检血清0.5ml 2、加入1：10稀释布氏菌抗原0.5ml 37度24小时观察结果
评价
▪ 简便、快速易行，具有较好的特异性， ▪ 有一定的敏感性，检查牛的阳性率稍
高于绵山羊。
▪ 该法可用于大面积检疫。
（4）、补体结合试验(CFT)
原理
受检系统 1.仅有抗体
指示系统
红细胞
抗体
补体
2.仅有抗原
抗原
溶血素 红细胞
补体
3.抗原抗体反应
符合率
BSL－2：实验室设施 (二级屏障)
人间布病诊断方法和判定标准
1、流行病学接触史： 密切接触家畜、野生动物、畜产品、 布鲁氏菌培养物等或生活在疫区内的居民。 2、临床症状和体征:应排除其他疑似疾病。 3、实验检查：病原分离
试管凝集试验 补体结合试验 抗人球蛋白试验 参考：（皮内变态反应试验、虎红平板凝集试验）
器材及试剂：
布氏菌素、酒精棉球，1ml注射器，测量尺
皮内变态反应操作方法
1.每次注射前必须详细询问职业、健康情况曾否
接种过布氏菌活菌苗等。 2.前臂掌侧中部皮肤用75%酒精棉球消毒，待干
后，用1ml注射器皮内注射0.1ml。 3.判定反应时间：注射后24、48h各观察一次
（以48H结果为准）。 4.判定反应标准：阳性反应局部红肿达2x2cm或
同时配置比浊管便于结果判定
稀 试管凝集反应（SAT）示意图(1) 释 血 清
稀释度
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
1:25 1:50 1:100 1:200 1
1:20稀释抗原 生理盐 清亮度 水
标记
1
0.00
1.00
采用何种方法、 取何种材料、 何种培养基 实验室条件
布氏菌的分离培养
一、从可疑病人分离布氏菌 血培养： 30天未培养出菌，可定位阴性 。 骨髓培养：抽取骨髓（接种双相培养基） 尿培养： 其他病原材料培养:乳、脑脊液、关节液
和滑囊液分离布氏菌，参照血培养观察 结果，15天不长菌定为阴性
100%
++++
2
0.25
0.75
75%
+++
3
0.50
0.50
50%
++
4
0.75
0.25
25%
+
5
1.00
0.00
0%
-
每次试验须作三种对照
▪ 阴性血清对照 ▪ 阳性血清对照 ▪ 抗原对照
结果判定： 根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应程 度（滴度），特别是50%清亮度（++）对判 定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。
布鲁氏菌病原学、血清学诊断
丽水市疾病预防控制中心 兰进权
主要内容：
1、布鲁氏菌病原学； 2、布鲁氏菌诊断标准； 3、布鲁氏菌血清学实验的几种方法。
（一）布氏菌概述
1887年英国医生布鲁氏首先从死于“马尔他热”的英 国士兵脾脏中分离出羊种布氏菌后，布鲁氏菌属 （Brucella)，包括6个种19个生物型。 羊种布氏菌（Br melitensis) 牛种布氏菌（Br abortus) 猪种布氏菌（Br suis) 沙漠森林野鼠种布氏菌（Br neotomae) 绵羊附睾种布氏菌（Br ovis) 犬种布氏菌（Br canis)