主要培养基：10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。

500×B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。

100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃。

10×D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。

500×生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。

100×H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。

10×M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。

10×GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。

100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。

1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。

过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。

100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。

用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。

LB培养基：5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。

LB平板培养基在LB液体培养基中加入琼脂粉15g，高压灭菌，冷却至45℃左右时倒平皿，4℃保存。

LA平板培养基待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp (100μg/mL)，摇匀后倒平皿，4℃保存。

YPD培养基：1%酵母提取物，2%胰蛋白膝，2%葡萄糖；RDB转化固体培养基：(Regeneration Dextrose Medium+ Histidine)（lmol/L山梨醇，l%葡萄糖，1.34% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate with amino acids(YNB)，0.00004%Biotin，0.005%谷氨酸，0.005%甲硫氨酸，0.005%赖氨酸，0.005%亮氨酸，0.005%异亮氨酸，1.5%琼脂；）100mL：超纯水80ml，山梨醇18g(186g/L)，琼脂糖2g（20g/L）121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D（20%葡萄糖）10ml, 500*B（0.02%生物素）0.2ml 100*AA（含每种氨基酸0.5%）1ml.混匀，倒平板。

YPD-遗传霉素平板：1%酵母浸出物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%不同量的遗传霉素4.0，250mL （8-10个遗传霉素平板）。

取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液或PBS中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。

具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。

HEPES缓冲液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl,0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。

0.50mg/ml，0.75mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml，4.0mg/ml五个梯度MD：选择培养基：(Minimal Dextrose Medium+ Histidine) （1.34%YNB，0.00004%Biotin，2%葡萄糖，1.5%琼脂；）100mL：向80 mL 超纯水中加入琼脂糖2g（20g/L），121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D（20%葡萄糖）10ml, 500*B（0.02%生物素）0.2ml，混匀，倒平板。

MM：选择培养基：(Minimal Methanol+ Histidine )（1.34%YNB，0.00004%Biotin，0.05%甲醇，1.5%琼脂；）100mL：向90 mL 超纯水中加入琼脂糖2g（20g/L），121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, , 500*B（0.02%生物素）0.2ml，5mL甲醇混匀，倒平板。

BMGY：诱导表达培养基(Buffer Glycerol-complex Medium)（1%酵母提取物，2%蛋白陈，100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，0.00004% Biotin，l%甘油(V/V)；）1L：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO4 11.8G/L，超纯水890Ml，121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 100ml, 500*B（0.02%生物素）1ml，甘油10mL。

BMMY：诱导表达培养基(Buffer Methanol-complex Medium) 除以0.5%甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同。

1L：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO411.8G/L，超纯水895Ml，121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 100ml，500*B（0.02%生物素）1ml，5mL甲醇。

主要溶液2*SDS样品缓冲液：25mL 4*Tris•HCl，PH6.8(0.lmol/L) 20mL甘油[20%(w/v)]4g SDS[4%(w/v)] 2mL2-巯基乙醇或3.1g DTT1mg溴酚兰[0.001%(w/v)]加蒸馏水至l00mL并混匀，等量分装成lmL于-70℃贮存。

5*SDS电泳缓冲液：15.lgTris碱(0.125mol/L) 72.0g甘氨酸(0.96mol/L) 5.0g SDS[0.5%(w/v)]使用前稀释至1XSDS电泳缓冲液，贮存液不必调教pH值，稀释后溶液pH8.3，使用前于0-4℃保存。

考马斯亮兰染色固定液：50%(v/v)甲醇10%(v/v)乙酸40%重蒸水染色液：50%(v/v)甲醇0.05%(v/v)考马斯亮兰R-25040%重蒸水10%(v/v)乙酸配制时先用甲醇溶解考马斯亮兰，再加入乙酸和水。

溶液可保存6个月，若出现沉淀，滤除即可。

脱色液：7%(v/v)乙酸5%(v/v)甲醇88%重蒸水一、大肠制备感受态细胞需灭菌的设备大离心管：小离心管：50ml大枪头5mlLB培养基：10%甘油1 挑单个大肠接入LB液体培养基，培养过夜37℃摇床，并做抗性对照。

2以1：100比例接菌，进行大摇（2ml接入200ml 培养基中37℃摇床）3OD达到0.5-0.7时，冰上放置20min。

4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余4加入等体积的10%甘油轻轻重悬。

4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余5加入1/2体积的10%甘油轻轻重悬。

4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余6加入1/4体积的10%甘油轻轻重悬。

4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余7加入适量灭菌10%甘油，一般500ml菌液加入2ml甘油，重悬，8分装，每管40ul，先冻与液氮，然后放入-80℃保存二、毕赤酵母GS115电转化感受态的制备1．在含5mLYPD的50mL 离心管中，培养P. pastoris，30℃过夜；2．取0.1-0.5mL过夜培养物，接种含50mL新鲜培养基的摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5；3．在4 ℃，1 500 r/min离心5min收集细胞，用5mL预冷的灭菌水悬浮细胞；4．如上离心，用5 mL预冷的灭菌水悬浮细胞；5．如上离心，用2mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞；6．如上离心，用1 mL 预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5mL（可冻存80μL等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多）。

三、毕赤酵母电转化1．取80μL上述细胞与5-10μL经S线性化DNA（约5-20ug）混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中；2．在冰上放置5min；3．根据所使用装置推荐的S. cerivisiae参数进行电击(1 500V，5ms)；4．立即加入1mL 预冷的1mol/L山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；5．分成200-600μL等份，涂于RDB平板上，进行His营养缺陷筛选；6．在30℃孵育平板3-5d，至His+克隆产生。

四．G418筛选多拷贝基因1）取出长有克隆的3块板，可考虑先挑10－20个菌落先表达；2）第一块加入2ml 灭菌的ddH2o，用涂布棒打匀，洗后，菌液吸入第二块；3）第二块加入1ml，洗之，吸入第三块；4）菌液吸入EP管，可适量补充ddH2o；5）混匀后取适量稀释约50倍，4ul×50＝200ul每块G418板，G418浓度从0.25－4.0mg/ml各一块；6）注意涂布均匀，可适量补充ddH2o，7）300C烘箱培养，2－5day，其余菌液可40C保存注：a）手册推荐方法：第4）步将菌液转入EP管中，振荡5－10秒，用分光光度计测菌体密度，1OD600＝5×107 cells/ml, 取一定体积稀释至200ul/每块G418板, 涂布～105 cells；注意agar的存在会干扰分光光度计的读数。

五．表达：1）从G418板挑单克隆入4ml/管MGY接种，300C，250rpm，2天左右至OD＝2－6，颜色乳白；2）取1ml菌液于EP管中保种，余3ml菌液离心，1500g，5min，菌体换3ml BMMY，加千分之五甲醇，300ul/管；3）每隔24小时加千分之五甲醇；4）至表达之日起2天后每天取样80ul，留作电泳分析；5）表达4天结束，1500g离心，5min，分别收集上清和沉淀；6）上清用作蛋白分析，跑SDS-PAGE电泳，Western Blotting分析，ELISA分析，样品浓缩，纯化分析等六．质粒提取（碱裂解）（1）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 配制200ml。