玉米秸秆酶水解工艺的初步研究
本实验以酶水解产生的还原糖含量为指标来评价纤维素酶水解效果，研究了温度、pH值、酶浓度、底物浓度、及酶解时间等单因素对玉米秸秆水解效率的影响，结果表明：酶水解的最佳温度为50℃～55℃，酶浓度为0.9g/L，pH5.0，底物浓度为50g/L，最佳反应时间为48h。
根据单因素试验结果，设计了五因素四水平正交实验，通过正交实验得出酶水解玉米秸秆的最佳工艺是：pH5.0，反应时间36h，温度60℃，酶浓度0.9g/L，底物浓度为50g/L。
标签：玉米秸秆酶水解纤维素酶正交试验
一、实验材料与方法
1.实验材料
1.1主要原料：玉米秸秆[1]
1.2主要试剂：：DNS（3，5-二硝基水杨酸）试剂、0.1mol/L的柠檬酸溶液、0.1mol/L的柠檬酸钠溶液、3%的NaOH水溶液
2.实验方法
2.1 原料的预处理：粉碎→碱浸泡→抽滤→干燥
2.2 还原糖的测定方法：本研究采用DNS法[2]。
2.3 葡萄糖标准曲线的绘制
2.4 纤维素酶水解条件的优化
影响木质纤维原料酶水解的因素主要包括：底物浓度、酶浓度和反应条件（如温度、pH值等）[3]。
为了提高葡萄糖的产量和纤维素的水解率，本文在优化水解工艺和提高纤维素酶的活性方面作了大量的实验研究。
2.4.1 底物对酶水解影响的研究
底物（经预处理的玉米秸秆）可以影响酶水解速率和发酵糖的得率[4]。
实验条件为：在6只150mL的锥形瓶中分别加入质量为0.4g、0.6g、0.8g、1.0g、1.2g、1.4g的经过预处理的玉米秸秆原料，并加入20mL的蒸馏水，再用移液管加入15mL、pH为5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，摇匀，在锥形瓶瓶口盖上保鲜膜，并用橡皮筋绷紧。
取5只试管，分别加入5mL，0.3g/mL的酶液，与锥形瓶一起放入设定温度为50℃的恒温水浴锅中分别预热5min。
预热5min后取出将装在5只试管中5mL，0.3g/mL的酶液分别倒入5只锥形瓶中，摇匀，重新
盖上保鲜膜并绷紧，然后放入设定温度为50℃，180r/min的全温震荡培养箱中震荡培养24h，使之充分的进行酶解反应。
之后将锥形瓶取出，将里面的酶解液倒入50mL的离心管中，在50℃，10000r/ min离心机中离心10min。
取出后用移液枪取其中上清液即酶水解糖液2mL分别倒入干净的试管中，并在此基础上加入1.5mL的DNS。
在100℃的HH-S数显恒温水浴锅中煮沸5min，取出，迅速到流动的凉水中冲凉。
最后用分光光度计在波长为540nm下测量试管中酶水解糖液的吸光度，比较不同底物浓度下水解出的还原糖的浓度。
本实验是单因素分析，是个对比试验，因此试验过程中要注意贴上标签，防止混淆。
为了防止实验过程中底物具有一定的吸光度所带来的影响，本实验设置了对照组，6组对照组的底物分别为0.4g、0.6g、1.8g、1.0g、1.2g、1.4g经过预处理的玉米秸秆。
對照组的实验条件与实验组的实验条件的区别就是加入酶解液是在100℃的HH-S 数显恒温水浴锅中煮沸5min进而失活的酶液。
因此，对照组与实验组的却别仅在于有无还原糖的产生，消除了其他底物的吸光度对实验数据的影响。
2.4.2 纤维素酶对酶水解影响的研究[5]
参照底物对酶水解的实验条件，只将酶液的浓度改变为：0.1g/mL，0.3g/mL，0.6 g/mL，0.9 g/mL，1.2 g/mL，1.5 g/mL的酶液，其它条件均相同，最终6组对照组分别是浓度为0.1g/mL，0.3g/mL，0.6 g/mL，0.9 g/mL，1.2 g/mL，1.5 g/mL100℃水浴下失活的酶液。
最后用分光光度计在波长为540nm下测量试管中酶水解糖液的吸光度，比较不同酶浓度下酶水解出的还原糖的浓度。
2.4.3 pH对酶水解影响的研究
酶催化反应在相当程度上受pH值的影响。
参照底物对酶水解的实验条件，只将pH分别设定为3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8，其它条件均相同，最终6组对照组分别中加入缓冲液pH为3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8的100℃水浴下失活的酶液。
最后用分光光度计在波长为540nm下测量试管中酶水解糖液的吸光度，比较不同pH下酶水解出的还原糖的浓度。
2.4.4 反应温度对酶水解影响的研究
温度主要影响酶活力，从而影响酶解率。
参照底物对酶水解的实验条件，只将温度分别设定为35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，其它条件均相同。
在6组对照组分别为35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃反应条件下，加入的100℃水浴下失活的酶液进行反应。
最后用分光光度计在波长为540nm下测量试管中酶水解糖液的吸光度，比较不同温度下酶水解出的还原糖的浓度。
2.4.5 反应时间对酶水解影响的研究
参照底物对酶水解的实验条件，只将培养时间设定为12h，24h，36h，48h，60h，72h，其他条件均相同。
最终6组对照组分别是反应时间为12h，24h，36h，48h，60h，72h条件下加入失活的酶液。
最后用分光光度计在波长为540nm下测量试管中酶水解糖液的吸光度，比较不同酶浓度下酶水解出的还原糖的浓度。
二、结果与分析
1.葡萄糖标准曲线
按照葡萄糖标准曲线测定方法，绘制葡萄糖标准曲线得到回归方程，根据R2值可知该标准曲线的线性良好，可以使用。
可根据测得的方程y = 4.916x-0.3652计算相应的还原糖含量。
2.底物浓度对酶水解的影响
在pH为5.0，温度为50℃，酶浓度为0.3g/L，反应时间为24h的条件下，测定了不同底物浓度对酶水解效果的影响。
结果表明：随着底物浓度的增加，产生的还原糖量也增加，但底物达到一定浓度时，还原糖增加的比例较小，纤维素原料水解得率降低。
从图中可以看出该酶的最适底物浓度为50 g/L，在最适底物浓度下，酶水解得到的还原糖为最多，达0.542mg。
3.酶浓度对酶水解的影响
在pH为5.0，温度为50℃，底物浓度为30g/L，反应时间为24h的条件下，测定了不同酶浓度对酶水解效果的影响。
结果表明：当纤维素酶的用量为0.9 g/L 时，还原糖的含量为0.574mg。
而当纤维素酶用量大于0.9 g/L的时候，酶解产生的还原糖含量为0.575mg，几乎不再增加，因此最适酶浓度为0.9 g/L。
4.pH对酶水解的影响
在底物浓度为30g/L，温度为50℃，酶浓度为0.3g/L，反应时间为24h的条件下，测定了不同pH对酶水解效果的影响。
结果表明：纤维素酶对pH的变化敏感，在pH值为5.0时，此时酶活性最高，酶水解产生的还原糖最多，达0.490mg。
因此，最适pH为5.0。
5.温度对酶水解的影响
在pH为5.0，底物浓度为30g/L，酶浓度为0.3g/L，反应时间为24h的条件下，测定了不同温度对酶水解效果的影响。
结果发现在50℃到55℃之间酶水解产生的还原糖的含量最多，达0.490mg。
在最适温度以下，随着温度的升高，纤维素酶水解速度加快。
超过最适温度，纤维素酶活力减小，水解速度反而下降。
如果温度过高，纤维素酶甚至发生完全不可逆失活。
因而，纤维素的酶水解需控制在一定温度范围，才能使水解率达到最大值。
6.反应时间对酶水解的影响
在pH为5.0，底物浓度为30g/L，酶浓度为0.3g/L，反应温度为50℃的条件下，测定了不同温度对酶水解效果的影响。
结果表明：在酶水解反应初始阶段，纤维素酶水解得还原糖浓度增加较快，随着水解时间延长，水解速度减缓，反应到48h，还原糖的含量达0.565mg。
当反应时间大于48h，还原糖浓度上升趋势
逐渐平缓。
即水解速度随着时间t变化而变化，当水解时间短时，水解速度非常快，隨着水解时间增加，水解速度变得很慢，直到最后趋于平衡，所以酶水解反应最佳时间为48h。
7.正交实验
对反应系统中的pH，温度，反应时间，酶浓度和底物浓度，设计了5因素4水平正交实验。
结果可知，影响纤维素酶水解玉米秸秆效率的因素主次顺序为酶浓度> 反应时间>温度>pH>底物浓度，即酶浓度对纤维素酶水解效率的影响最显著，底物浓度对纤维素酶水解效率的影响最不显著。
结果可知纤维素酶水解玉米秸秆条件的最佳组合为酶浓度0.9g/L，pH5.0，温度60℃，反应时间为36h，底物浓度为50g/L。
为了验证正交实验的准确性，采用在最佳条件组合酶浓度0.9g/L，pH5.0，温度60℃，反应时间为36h，底物浓度为50g/L，测量酶水解玉米秸秆产生的还原糖高达0.581mg。
验证了正交的实验的准确性，同时也更加说明了最佳条件的可行性。
三、结论
通过正交实验结果得知，酶水解的最佳条件组合是pH为5.0，反应时间36h，温度为60℃，酶浓度为0.9g/L，底物浓度为50g/L。
最佳条件下得到的还原糖产量为0.581mg。
参考文献
[1]韩鲁佳，刘向阳，胡金有.中国农作物秸秆资源及其利用现状.农业工程学报2002，18（3）：87～91
[2]DNS测还原糖的原理http：///view/453bbfc7aa00b52acfc7caf1.html
[3]高洁，汤烈贵.纤维素科学.北京科学出版社。
1996，183～189
[4]李稳宏，吴大雄，李宝璋.麦秸纤维素酶解法制糖研究[J] .化学工程，1998，26（1）：54-61.
[5]上久保正等.纤维素酶的水解.应用微生物，1984，（4）：p31-35.。