1.方法原理薄层色谱是一种微量分析的分离过程，它将样品点在以玻璃板或铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上,利用流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移到不同距离处，在色谱展开整个过程中，样品的成份受到正反不同的力的作用。

(1) 流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相。

(2) 样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极 - （诱导） - 偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。

由于样品组份与流动相和固定相之间的相互作用力程度不同，整个毛细管流动过程中分离运动都在进行。

基于这点，TLC系统（流动相和固定相）必须与样品很好地匹配。

用显色试剂处理，许多组份可在日光或紫外灯光下检视。

色谱可用肉眼或使用光密度计和照相机记录或影像系统方法来评价。

2. 薄层板2.1手工自制板，最好使用厚薄1~2mm的优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄层板，玻璃板需洗净至不挂水，晾干，贮存于干燥洁净处备用。

玻璃板反复使用时，应注意经常用洗液及碱液清洗，保持玻璃板面的光洁是保证薄层板质量的最基本要求，将1份吸附剂加适量的水（如1份硅胶G一般加3份水），在研钵中用研杵沿一个方向小心研磨至成均匀的有适当粘稠度的胶浆,立即倾入涂布器中,均匀地向前推进涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的规定操作涂布;涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干,再在规定的温度(一般为105℃~110℃)下烘约30分钟活化,贮于干燥器中备用。

薄层板的厚度一般为0.25~0.5mm.。

2.2 商品化供应的预制板和高效板20x20cm 10x20cm 20x10cm 10x10cm图1 不同的板尺寸TLC/HPTLC预制板有不同的规格供应。

常用的尺寸为20 x 20，10 x 20，20 x 10，或10 x 10 cm。

使用的规格取决于TLC或HPTLC的类别和样品的数目。

2.2.3 TLC/HPTLC板的预洗及活化一般来说，色谱板应用溶剂如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更强的洗脱溶剂的混合物进行预洗。

具体操作可通过空白色谱展开来实现。

色谱板预洗完后,应在105°C加热1小时进行干燥，再在室温下置放至少2小时（需采取保护措施以防止实验室空气中的污染物重新附着在其上面，如放置在空的干燥器中）。

3. 样品点样3．1点状点样和条带状点样每次点样前，TLC/HPTLC板应在正常光线下和紫外灯下用肉眼检查薄层的损伤情况和杂质，只有无损伤、清洁的TLC/HPTLC板方可使用。

样品可进行点状或条带状点样。

要想获得最佳的薄层分辨率，必须保证移行方向中的起点要小，常规的TLC薄层点状点样每次点0.5至5微升，相比之下，HPTLC薄层最大点样量为1微升。

点样量较大的样品可使用自动化装置点样，喷雾成条带状是一种可以点样量大而同时又能促成最有效分离的点样方法。

在常规操作过程中，人工点样一般使用微量毛细管（0.5/1/2/3和5 µl），点样时毛细管必须完全充满和完全排空，要以垂直方向小心接触TLC/HPTLC板面，不要损伤薄层，受损的薄层会导致溶剂不规律地流动而在色谱上产生失真的TLC谱带。

人工点样建议使用Nanomat。

它点样位置精确并安全，使薄层免于受损。

用适当的介质干燥Nanomat也可用作单个量的多次点样。

样品体积大于5 µl，通常用如Linomat或Automatic TLC Sampler III的方法用氮气喷雾成窄条。

若（就是）要求点状样品点样，Linomat 和Automatic TLC Sampler III应将条长度设定在1至2 mm。

3.2 样品点样位置起点的最佳位置如图2和3所示。

起点下缘的最小距离b取决于溶剂量。

两个起点之间的距离c必须令平行移行的主成份不会相互触及。

点状点样时原点的直径应小于或等于3mm（高效板原点的直径应更小）,条带的长度d由点样样品体积或样品的种类和相对于板的尺寸点样的数目来决定。

到板侧边的距离a必须足够大以避免分离区失真变形（见图2和3）。

图2：斑状样品点样的一般点样位置（a = 20mm, b = 10mm, c =两起点之间的距离。

）图3：条状样品点样的一般点样位置（a = 20mm, b = 10mm, c = 两起点之间的距离，d = 条的长度）。

4.层析4.1展开室具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿度等优点。

4.1.2 水平展开室可以从薄层板的两侧向中间水平地展开，这样可使一块薄层板所承受的样品个数比常规上行展开的薄层板增加一倍。

4.1.3 自动展开室(AMD) 可使用五种溶剂对同一薄层进行多次展开，自动控制预饱和、展开方式、展开距离和干燥条件，分离效率比传统方式提高三倍（可在80mm之内分离40种成分），符合GLP/GMP要求。

4.2. 溶剂使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”，溶剂组成采用体积量比（如正丁醇 - 冰乙酸 - 水 = 4：1：1，V/V/V），或者绝对量（如18ml甲苯 + 2 ml甲醇）。

其总量应足以使TLC/HPTLC板的浸入深度约为5mm。

展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用,如需分层，则按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层），备用。

在双槽展开室中，对每种类型和规格和层析板，每槽通常注入的溶剂数量如表3。

表3：板的规格板的尺寸（宽×高）溶剂量预制板20×20cm20×10cm10×10cm 25ml15ml8ml高效板20×10cm10×10cm 10ml5ml（1）硫酸（sulphuri acid）通用显色剂。

试液：a、5%浓硫酸乙醇或乙酐溶液b、浓硫酸与甲醇或乙醇等体积混合c、15%浓硫酸正丁醇溶液方法：用以上任一试液喷洒或浸湿晾干，于110摄氏度加热至呈色，或达最强荧光。

（2）碘（iodine）通用显色剂。

试液：a：0.5%碘的氯仿溶液。

喷后处理：待薄层上过量碘挥散，喷1%淀粉溶液，斑点转为兰色，如有过量碘留在薄层上，则背景也呈兰色。

b：碘蒸气：将少许碘晶体放入一密闭的容器内，使之充满饱和碘蒸气，将薄层放入容器片刻或数分钟即显色。

有时在容器内放一小杯水增加湿度，可提高显色的灵敏度，可提高显色的灵敏度。

在化合物斑点处显黄-棕色。

（3）磷钼酸（molybdophosphoric acid）用于还原性化合物、类脂、甾体化合物等。

试液：5%或10%磷钼酸乙醇溶液喷或浸后处理：于120摄氏度加热至最佳颜色形成，如将薄层放入含25%氢氧化铵溶液的容器内，可使背景颜色消退。

（4）香草醛-硫酸（vanillin-sulphuric acid）用于精油、高级醇、酚等试液：香草醛1g溶于100ml硫酸或香草醛0.5g溶于100ml硫酸-乙醇（1：1）溶液。

喷或浸后处理：于120摄氏度加热至颜色最深。

（5）三氯化铁（ferric chloride）用于酚类、羟酰胺酸。

试液：1%~5%三氯化铁的0.5mol/L盐酸溶液。

注：酚类呈兰色或绿色，羟酰胺酸呈红色。

（6）三氯化铝（aluminium chloride）用于黄酮类化合物。

试液：1%三氯化铝乙醇溶液，紫外光长波下斑点显黄色荧光。

（7）碘化铋钾试剂（dragendorff reagent)用于生物碱和某些含氮化合物。

试液：a：次硝酸铋0.85g溶于10ml冰乙酸与40ml水中。

b：碘化钾8g溶于20ml水中。

方法：试液a和b等量混合，置棕色瓶保存试液。

用前将试液1ml加2ml冰乙酸和10ml水混合。

注：显色斑点呈橙红色。

（8）茚三酮（ninhydrin）用于氨基酸、胺与氨基糖类试液：茚三酮0.2g溶于乙醇100ml或溶于100ml正丁醇，加乙酸3ml。

喷或浸后处理：于110摄氏度加热至最佳颜色出现。

（9）邻苯二甲酸苯胺用于还原糖。

试液：苯胺0.93g和邻苯二甲酸1.66g溶于100ml以水饱和的正丁醇中。

喷或浸后处理：于105摄氏度加热10min，醛己糖及甲基戊糖呈棕色，醛戊糖呈樱桃红色（10）硫酸铈：用于生物碱配制方法：10%硫酸铈(IV)+15%硫酸的水溶液（11）桑色素(羟基黄酮) 通用显色剂, 有荧光活性配制方法：0.1% 桑色素+甲醇（13）二硝基苯肼(DNP) 用于醛和酮配制方法：12g二硝基苯肼+ 60mL 浓硫酸+ 80mL 水+ 200mL 乙醇（14）高锰酸钾用于含还原性基团化合物，比如羟基，氨基，醛配制方法：1.5g KMnO4+ 10g K2CO3+ 1.25mL 10% NaOH + 200mL 水. 使用期3个月（15）溴甲酚绿用于羧酸，pKa<=5.0配制方法：在100ml乙醇中，加入0.04g溴甲酚绿，缓慢滴加0.1M的NaOH水溶液，刚好出现蓝色即至。

（16）钼酸铈通用显色剂配制方法：235mL 水+ 12g 钼酸氨+ 0.5g 钼酸铈氨+ 15mL 浓硫酸（17）茴香醛(对甲氧基苯甲醛)1 通用显色剂配制方法：135乙醇+ 5mL 浓硫酸+ 1.5mL of 冰醋酸+ 3.7mL 茴香醛，剧烈搅拌，使混合均匀.茴香醛(对甲氧基苯甲醛)2 用于萜烯，桉树脑(cineoles), withanolides, 出油柑碱(acronycine)配制方法：茴香醛:HClO4:丙酮:水(1:10:20:80)（18）醋酸改良碘化铋钾试液的配制：A．取次硝酸铋0.52g加冰醋酸6ml，纯化水24ml；B．取碘化钾12g加纯化水3 0ml。

将A、B两液混合，再加纯化水120ml，冰醋酸160ml即得。

实例谈薄层色谱展开剂选择根据本人的几年薄层层析经验，参考药典等国家药品标准和有关文献，将2000版药典一部里部分有代表性的对照品的薄层层实例按展开剂极性排序，并对其规律做一些分析。

以下的分析和介绍是总体描述性的，目的是快速、简便地选择展开剂。

如果想了解展开剂选择的各种理论，请参考其他专著。

选择展开剂，要依据溶剂极性和他们的混溶性，溶剂对被分析物的溶解性，以及被分析物的结构。

这里只讨论药典里通常使用的以硅胶为固定相主体的正相薄层，也不考虑板的活性。

E( 5LQ3Y列出溶剂极性参数表，方便以下比较展开剂。

环已烷:-0.2、石油醚（Ⅰ类，30~60℃）、石油醚（Ⅱ类，60~90℃）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、异丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氢呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2 [1] 。

关于溶剂混溶性，一般根据相似相溶原则，需要注意，极性相差大的不混溶，比如正己烷与甲醇。

多元展开剂，主体的两种溶剂不能混溶，就需要通过第三种溶剂来调和。