普通生物化学实验教学大纲一、课程说明生物化学实验是生命科学中探索生命奥秘的重要实验方法之一，主要是通过实验方法了解组成生物体的大分子物质氨基酸、蛋白质、酶、核酸、维生素、脂类等的组成、结构、性质、功能。

二、教学目的及要求1、掌握生物化学中的基本原理在实验中的应用及验证。

3、熟悉并掌握基本生化技术色谱、电泳、离心等的基本原理及操作技术。

4、能够运用所学知识综合解决现实生活中的基本问题。

5、培养学生解决问题的严谨的思维能力。

6、使学生了解生物化学在实验教学中的重要性。

培养学生严谨的科学态度和良好的习惯。

培养学生团结互助的团队精神，建立良好的友谊。

三、教学重点及难点1、重点：实验中的基本原理、基本操作、实际中简单及综合应用。

2、难点：某些较抽象的原理的理解及阐述。

四、与其它课程的关系生物化学是生命科学的基础专业课之一，在大学二年级第一学期开始开设，目的是为以后开设与之密切相关的专业课如动植物生理学、遗传学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等打下良好的基础。

五、学时、学分学时：30学分：3六、实验内容实验一氨基酸的分离鉴定----纸层析法（一）目的通过氨基酸的分离，学习层析法的基本原理及操作方法。

（二）主要教学内容1、分配层析的原理。

2、基本操作。

（三）注意事项1、点样点直径不要超过3毫米。

2、一定用铅笔做标记。

3、手不要摸滤纸4、原点不能浸如展层剂5、以组为单位作出层析图谱。

实验二蛋白质性质实验一蛋白质及氨基酸的呈色反应（一）目的学习呈色反应原理，掌握鉴定蛋白定性鉴定的方法。

（二）主要内容双缩脲反应、印三酮反应、黄色反应、考马司亮兰反应实验三蛋白质性质实验二蛋白质的等电点测定和沉淀反应（一）目的学习蛋白质的等电点测定，了解沉淀与变性关系。

（二）主要内容1、蛋白质的等电点，蛋白质在等电点时的特性，测定原理2、沉淀不一定变性，变性不一定沉淀。

了解变性与降解关系。

实验四血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳（一）目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。

（二）主要内容1、电泳的一般原理2、醋酸纤维薄膜电泳的操作（三）注意事项1、点样一定要细且均匀。

2、调整好电压和电流。

实验五、六总氮量的测定--微量凯氏定氮法（一）目的学习凯氏定氮法的原理和操作技术（二）主要内容1、原理：蛋白质系数。

2、操作：样品的处理及消化；蒸馏；滴定；数据处理（三）注意事项1、一定消化完全。

2、消除所有可能对实验结果造成的误差。

实验七动物组织中核酸的提取（一）目的了解核酸的组成，掌握鉴定核酸组成的方法（二）主要内容1、原理2、操作匀浆的制备；抽提；沉淀；水解；鉴定（三）注意事项1、离心时一定要平衡。

2、研磨一定彻底，否则量少鉴定现象不明显。

实验八酶的特性（一）目的加深对酶的催化特性及专一性的认识（二）主要内容1、温度对酶活力的影响2、pH对酶活力的影响3、激活剂、抑制剂对酶活力的影响4、酶的专一性（三）注意事项1、pH值配制一定准确。

2、酶量、底物的量一定合适。

实验九V C的定量测定（一）目的1、学习V C定量测定法的原理和方法2、进一步掌握熟悉微量滴定法的操作技术（二）主要内容1、样品提取液的制备2、标准VC的滴定3、样品的滴定4、数据的处理（三）注意事项滴定要迅速。

实验十谷丙转氨酶的活性鉴定（一）目的学习应用纸层析法鉴定移换反应（二）主要内容1、肌肉糜的制备2、氨基移换反应3、层析4、数据处理（三）注意事项一定用铅笔，药品不要弄混，注意酶反应的合适pH值。

生物技术专业生物化学实验技术教学大纲一、课程说明：生物化学实验技术是生物技术专业重要专业课之一。

重点要求学生掌握生化技术的基本原理，训练学生基本生化技术操作能力、分析问题解决问题的能力。

二、教学目的及要求：1、理论部分：熟悉现代生化技术的基本原理及应用。

2、实验部分：独立完成典型生化技术的基本操作，包括试剂配制、仪器使用、结果分析。

三、重点及难点：1、重点：生化技术的四大部分，包括：分光光度技术、色谱技术、离心技术、电泳技术。

2、难点：色谱技术及电泳技术的原理及操作。

四、与其他课程的关系：与微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学都有密切关系。

五、学时学分1、学时：722、学分：4实验部分实验一、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量（Bradford法）一、原理考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，溶液的颜色由棕黑转为蓝色，595nm比色，做出标准曲线。

在一定的蛋白浓度范围内，A595与蛋白浓度成正比。

二、试剂及仪器试剂：考马斯亮蓝G-250，BSA，95%乙醇，85%磷酸，二蒸水。

仪器：容量瓶，722分光光度计，试管，混合器。

三、实验操作1、配试剂：100mg考马斯亮蓝G-250 + 50mL95%乙醇+120 mL85%磷酸+水，共计1 L。

2、制备标准曲线：方法一，配置母液，按照教材各取一定量母液得到一个浓度梯度进行检测。

方法二，配置母液，用系列稀释方法得到浓度梯度进行检测。

各取0.1 mL蛋白液加5 mL考马斯亮蓝G-250，2min-1hr 595nm比色，绘标准曲线。

以标准蛋白浓度为横坐标，用吸光度值A595为纵坐标，得一直线。

3、样品测定：鸡蛋清蛋白液。

4、结果及分析。

写出实验报告。

实验二、凝胶层析法测定蛋白质的分子量一、目的学习凝胶层析的原理和操作，测定蛋白质的分子量。

二、原理凝胶层析也叫分子筛层析。

凝胶颗粒是具有多孔网状结构的珠子，对不同半径的蛋白质分子具有不同的排阻效应。

大分子流程短，小分子流程长，这样使不同分子大小的蛋白按大小不同依次流出，达到分离目的。

1、几个重要概念（1）固定相：指层析基质部分，包括固体物质如吸附剂、离子交换剂和液体物质如固定在纤维素或硅胶上的溶液。

（2）流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。

柱层析时，称为洗脱剂或洗涤剂；薄层层析时称为展层剂。

（3）床体积（Vt）指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积。

是基质的外水体积（Vo）和内水体积（Vi）以及自身体积（Vg）的总和。

即Vt= Vo+ Vi+ Vg（4）外水体积（Vo）：指基质颗粒之间体积的总和。

（5）内水体积（Vi）：指基质颗粒内部体积的总和。

（6）自身体积（Vg）：指基质自身所具有的体积。

（7）洗脱体积（Ve）：指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大时的流动相体积。

（8）膨胀度：在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（Vβ)。

即每克溶胀基质具有的体积。

一般亲水性基质得溶胀度比疏水性的大。

（9）分配系数（k）：指某一组分在固定相和流动相中含量的比值。

（10）迁移率（Rf）：指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。

K值大，表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大。

2、凝胶的种类及性质（1）葡聚糖凝胶（Sephadex G-），由葡聚糖和环氧丙烷通过醚键交联而成，型号有G-15、50、75、100、200，分别用于分离不同大小的蛋白质。

（2）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-），是以甲撑双丙烯酰胺作交联剂，需过硫酸铵作催化剂，TEMED作加速剂，将丙烯酰胺单体聚合而成。

型号有P-4、10、60、150、300，分别用于分离不同大小的蛋白质。

（3）交联葡聚糖与丙烯酰胺共聚凝胶（Sephacryl S-），由烯丙烷基葡聚糖和甲撑双丙烯酰胺共聚而成。

型号有S-200、300。

（4）琼脂糖凝胶（Sepharose Bio-Gel A-），由中性琼脂糖交联而成。

型号有AB、A-0.5m、A-50m。

3、葡聚糖凝胶过滤层析技术要点（1）型号选择：据分离的蛋白质大小确定。

（2）凝胶处理：沸水浴煮沸5h，冷却至室温。

装柱前减压抽气10min。

（3）装柱：先在柱内注入1/5的水，在插入一根直径稍小的长玻管至柱底部，灌胶后轻轻搅动。

装好的柱均匀，无纹理或气泡。

可用蓝色葡聚糖-2000验证。

（4）柱的检验和测定外水体积：用蓝色葡聚糖-2000检验。

测定。

（5）加样：分析用量一般为100ml床体积加1~2ml；制备用量一般为100ml床体积加20~30ml左右。

（6）洗脱：洗脱液应与浸泡溶胀凝胶所用液体相同。

流速与洗脱液加在装上的压力有关，一般用恒流泵控制。

（7）部分收集及分析：画出洗脱曲线，收集洗脱峰液分析。

（8）凝胶柱的再生及保存：倒出重装或用水反复逆向冲洗再平衡。

用后的葡聚糖凝胶可用0.02%叠氮钠溶液保存，避免用有机溶剂。

4、进行凝胶层析时，应考率的因素凝胶层析时，凡是影响样品的分离纯化（如分辨率，纯度）及样品活性的因素都必须考虑，主要的有：柱长的影响（影响分辨率和流速）；样品体积的影响（影响分辨率）；操作压的影响（影响流速和凝胶的性质，超过凝胶允许的静水操作压将破坏凝胶）；洗脱液pH（影响样品活性）；凝胶的类型等。

三、实验操作1、凝胶的准备2、装柱3、样品的制备4、加样与洗脱，做洗脱曲线四、注意事项1、装柱要均匀2、流速要适当五、教材及参考书1、教材：王秀奇，秦淑媛，高天卉等，基础生物化学实验（第二版），高等教育出版社。

2、参考书：李建武等，生物化学实验方法与技术，高等教育出版社。

实验三、SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量（一）、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及操作方法。

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰氨（Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。

前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率都较前者佳。

3、SDS-PAGE：为消除净电荷对迁移率的影响，在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在整个电泳体系中加入十二烷基磺酸钠（SDS），电泳的迁移率主要依赖于分子量，与所带电荷和形状无关，这种方法称为SDS-PAGE。

4、等电聚焦电泳：在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体，当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。

两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH值区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。

此技术已广泛应用于等电点测定、纯度分析，以及制备电泳纯样品等，但对在等电点时发生沉淀或变性的样品不合适。

（二）、主要内容1、凝胶的制备2、加样3、电泳4、取胶5、固定6、染色（三）、注意事项1、凝胶配制要准确2、取胶时要小心四、提取植物基因组DNA了解原理，掌握提取植物基因组DNA的方法试剂配制：EB储备液（10mg/mL）：1g EB溶于100mL水中，4℃避光保存。