分子生态学技术及其在环境微生物研究中的应用张于光!，李迪强!!，肖启明"（!#中国林业科学院森林生态环境与保护研究所，北京!$$$%!；"#湖南农业大学生物安全科技学院，湖南长沙&!$!"’）摘要分子生态学作为一门新兴的学科已经成为国内外科学家关注和研究的热点。
目前的分子生态学技术主要有核酸杂交分析技术、特异性()*扩增技术、+,-序列分析、基因芯片技术等。
这些技术在环境微生物研究中的应用主要包括对微生物多样性的研究、种群结构和动力学的研究、代谢活性的研究以及在全球气候变化中对微生物影响的研究。
最后，对环境微生物的分子生态学研究进行了展望。
关键词分子生态学；环境微生物；基因芯片；全球气候变化中图分类号.%/%#%文献标识码-文章编号!$$012$"!（"$$0）$01$$’21$&!"#$%&#’()%"#"*+,$%-."#"*+’./012344#5%’15".5.).65(".7$.1’#!5%("85"#"*+91&/+34-,567897:;9!，<=+>8?>:;9!，@=-A.>8B>;9"（!!"#$%&’(&)*$%+,&-!+#./)&#!0)&%*,%!12/#*$*3,45!&’(&)*$%)6，7*/8/#9!$$$%!；"!1&--!&’0-4#%0)&%*,%!:;#4#39)/,!<#/.!124#9$24&!$!"’）3821(’%1-C:D7E9F G;>;9C7D H F I J，B G K F I7K:E F I G K G9L M:C D F I G B F:M G J E F C F:E I M C N G J J M:J O E F P P G E K O P>O F C I>F;8 J>C J C’:J J F;J>G;#-J N E F C F;J，B G K F I7K:E F I G K G9L J F I M;G K G9L B:>;K L>C;7I K F>I:I>O M L D E>O>Q>;9O F J F I J>G;，()*:B N K>R>8 I:J>G;，+,-C F?7F;I F:;:K L C>C，9F;F I M>N，:;O G J M F E J F I M;G K G9L#S M F L:E F7C F O>;B>I E G D>G K G9L C J7O L B:>;K L>;B>8 I E G D>:K O>T F E C>J L，I G B B7;>J L C J E7I J7E F:;O O L;:B>I C，B F J:D G K>I:I J>T>J L，:;O J M F>B N:I J G R9K G D:K I K>B:J F I M:;9F C J G B>I E G G E9:;>C B C#S M F N E G C N F I J G RB G K F I7K:E F I G K G9L J F I M;G K G9L C J7O L P:C:K C G O>C I7C C F O#:$+;"(/2B G K F I7K:E F I G K G9L；F;T>E G;B F;J:K B>I E G D F；9F;F I M>N；9K G D:K I K>B:J F I M:;9F分子生物学及其技术的发展和变革为生态学的研究开辟了新途径，分子生物学与生态学的交叉领域，越来越引起人们的重视，分子生态学便应运而生，微生物分子生态学是其中的重要分支。
应用分子生态学技术，研究者不必培养微生物，而可以直接对环境微生物进行分析来达到目的。
分子生态学技术在环境微生物研究中的应用始于"$世纪’$年代中期，近年来在土壤、环境、海底沉积物、动物肠道等微生物生态系统的研究中得到了快速的发展，已经成为最富有活力的生态学科前沿领域之一。
<环境微生物+,-的获得从自然环境中直接分离微生物核酸，对不能培养的微生物的检测、对决定选择微生物或自然条件下重组基因的命运、对揭示基因型的多态性和在微生态中的变化都是很重要的［!］。
目前从环境样品中提取+,-的方法主要有"种。
首先是细胞提取法。
最初的报道是从土壤中提取细菌+,-，这种方法包括用不同的离心速度从土壤颗粒中分离细菌，然后溶解提取的细胞提取+,-，最后纯化+,-。
4G K D F;等以该方法为基础提取的+,-纯度足够可以对土壤细菌群落特定基因型进行探针检测，以及对提取+,-进行U G7J M F E;分析和限制性酶分析［"］。
第"种方法是直接溶解法。
该方法是由提取沉积物+,-发展而来［/］。
直接溶解后在缓冲液中用碱提取+,-，用乙醇沉淀、)C)K浓度梯度离心等纯化提取的+,-。
环境样品中提取+,-总是同时提取了腐殖物质的+,-，因而干扰了+,-的检测和收稿日期："$$&1$/1"$作者简介：张于光男，博士。
现主要从事环境微生物分子生态学研究。
项目来源：国家“十五”科技攻关项目（"$$!V-0!$V!$）；林业局重点项目“自然保护区社会经济生态价值研究”!通讯作者2’微生物学杂志"$$0年%月第"0卷第0期W A X*,-<A YZ=)*A V=A<A56U F N J#"$$0[G K#"0,G#0定量。
这些污染可能抑制!"#中的$%&’()聚合酶，干扰限制性酶的消化，降低转化效率和’()的杂交特异性［*，+］。
因为腐殖物质很难去掉，’()纯化是获得足够纯度的关键步骤。
目前发展了不少修改的方法来去除’()的杂质［,］，都取得了较好的效果。
!分子生态学研究的主要技术!-"核酸杂交分析技术核酸分子杂交技术是./世纪0/年代发展起来的一种分子生物学技术。
它是基于’()分子碱基互补配对的原理，用特异性的探针与待测样品的’()或#()形成杂交分子的过程［0］。
根据碱基互补配对的原则，被标记（放射性或非放射性的）的核苷酸探针以原位杂交、12345678印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹杂交等不同的方法，可直接用来探测溶液中、细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列。
核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使核酸分子杂交技术广泛应用于对环境微生物的检测，定性、定量分析它们的存在、分布、丰度和适应性等研究目的［9］。
!#!$%&扩增技术:;9+年，<3==>?发明了聚合酶链式反应（!"#）技术，该技术的产生给整个分子生物学领域带来了一次重大的革命。
同时，衍生出一系列的生物技术，它们在生态学中的应用，特别是在复杂环境中，对那些混合物内低含量的群体成员或生物群中某个特异基因的检测与研究成为可能。
根据扩增的模板、引物序列来源以及反应条件的不同可以将!"#技术分为：反转录!"#技术（#$@!"#）、竞争!"#（"@!"#）、扩增7#()限制性酶切分析技术（)#’#)）、随机扩增多态性’()技术（#)!’）等。
!#’()*序列分析最充分揭示’()多样性的方法是’()序列分析，尤其是核酸自动测序仪的普遍使用。
同时随着生物信息学的发展，已经有许多功能基因及专门的7#()序列数据库和软件供研究，使基因的序列分析可揭示更高水平的多态性。
!-+基因芯片技术基因芯片（<>A72%77%B）技术于:;;:年首次在1A>68A6杂志上被提出［;］，是生物芯片（C>2A5>D）的一种。
该技术是随着人类基因组计划的逐步实施和分子生物学的迅猛发展而产生的。
在短短的:/多年时间里基因芯片的研究和应用取得了巨大的进步［:/］。
与传统的多孔膜核酸杂交技术相比，玻片等为载体的基因芯片提供了更多的优点，如高密度、高灵敏度、快速实时检测、经济、自动化和低背景水平等［::］，所以，基因芯片技术能很好地适用于自然环境中的微生物群落的研究。
在探针排列类型的基础上，可以将用于环境研究的基因芯片主要分为E类［:.］。
首先是含有编码关于不同生物化学循环过程关键酶（例如去硝化）的功能基因芯片，该技术可以用于检测自然环境中微生物群落的生理地位和功能活动。
第.种是由含有源于核糖体核酸（7#()）基因探针的系统发育的寡核苷酸芯片，该芯片主要是用于微生物群落组成和结构的系统发育分析。
第E种是用纯培养微生物的整个’()基因组构建的群落基因组芯片，根据可培养的成分描述微生物群落。
’分子生态学技术在环境微生物研究中的应用’-"物种多样性的研究F2?46>8G2H?2B7和同事从土壤中提取’()的研究，是对环境中存在的大量神秘微生物基因组的首次探索之一［:E］。
他们估计:I土壤中含有大约*///种不同的原核基因组。
尽管仍然不清楚是否每个基因组代表一个不同的物种，研究的结果表明在一个土壤样品中的物种数超出了原来描述的原核生物种数［:E］。
大量以核酸为基础的不要求分离和培养微生物的方法，在用于检测环境样品中微生物群落的基因多样性中得到了广泛的应用。
简单的说，这些方法包括从自然样品中提取总的群落’()。
某些标记基因通过!"#得到扩增，个体基因通过克隆和测序得到分离。
这些标记序列是同源的，差异（替代／缺失）得到记数，序列间的进化距离用系统发育方法得到分析［:*］。
核糖体核酸（7#()）是常用于研究原核生物物种多样性的遗传标记。
在./世纪9/年代，(27J%8!%A6和同事就用核糖体方法研究环境中的微生物多样性［:*］。
他们的工作引起了对大量不同栖息地的研究，包括土壤、海水、沉积物、温泉沉积物等［:+］。
这些研究得到的结果可以总99微生物学杂志.+卷结如下：!在大多数的栖息地，微生物的基因组多样性是丰富的，但是很多物种不能培养；"几乎没有一个从环境中提取!"#获得的$%"#基因序列对那些存在于培养物种中是统一的；#与培养的微生物相比，在高度发散的系统发育树上的一些未知序列产生了新的系统发育关系［&’］。