图例:双克隆2
现象: 载体序列及插入片段前半部分峰图单一,套峰出现在插入片段中间
原因: 1. pcr产物不纯,且产物的引物结合区以及峰图单一的序列 都一样 2. 部分模板碱基发生突变,双峰出现的位点是由碱基突变 的位置决定的,有时会一端正常一端双峰(插入片断超过一 个反应测序长度(800~900bp)), 或者两个反应都双峰 解决方法: 重新挑单克隆
图例:非特异扩增
现象: 峰图起始即双峰
原因及解决方法: 1. 对于质粒样品, 引物在序列上有两个结合位点(载体上 和插入片段上),换一个引物测序 2.对于PCR产物,有两个模板,且两个模板都能和引物结合 扩增, 换引物或克隆测序
图例:等位基因双模板
现象:序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，没有发生移码突变
2.测序常见图谱分析
图例:双克隆1
现象: T载体序列峰图正常, 连接位置处出现套峰
原因: 1.有插入片段的载体和空载体同时存在 2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向 插入T载体 解决办法： 重新挑取单克隆
备注: 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段， 并不足以证明模板的单一
解决方法: 采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序
测序常见问题分析
主讲人: 张隽辉
LOGO
1. 序列结构对测序的影响
图例：poly结构Fra bibliotek原因: 主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上 滑动，导致随后的峰型变乱 或者移码 解决办法: 此类样品通过对其反向互补序列进行测序，通过 拼接可以得到模板全长序列.
图例：重复结构
原因: 重复结构会导致测序复制框的滑移，另外测序试剂采用 了I, U 代替G, T, 与模板结合能力较弱, 测序酶很难延伸, 信号会迅速衰减或峰谱很乱 解决办法： 使用反向引物对模板进行测序，测到重复序列反向互 补位置时，即可完成模板全长的拼接,一般测A\C重复 序列比G\T要容易一些
图例：回文结构
位点94至137碱基前后互补, 形成回文结构，该结构导致 后面的信号衰减，出现错误的判读。
图例: 特殊结构
现象: 信号在73bp（信号峰图2700处）突然中断， 测序PCR反应终止
原因: 变性后的单链在该处很可能互补或在全序列中有大的 特殊结构，造成严重的二级结构，使dNTP 和 ddNTP不 能和模板结合, 测序酶无法正常延伸 解决方法: 酶切,做亚克隆测序