组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC基因在胰腺癌耐药细胞株中的表达（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的:研究组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC在培美曲塞诱导的胰腺癌耐药细胞株Puta8988中的基因和蛋白表达水平，以明确HIST1H2AC和HIST1H2BC基因与胰腺癌耐药的关系。
方法:以两种剂量的培美曲塞诱导胰腺癌细胞株Puta8988，使其形成两个等级的获得性耐药细胞株Puta8988+、Puta8988++。
采用qRT PCR和Western blotting方法分别检测HIST1H2AC和HIST1H2BC在耐药细胞株及其亲本(对照)中的基因和蛋白表达水平。
结果:qRT PCR检测结果显示，组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC基因在胰腺癌耐药株Puta8988+和Puta8988++中的表达水平显著上调(P0.05);Western blotting检测结果显示，组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC在胰腺癌耐药株Puta8988+和Puta8988++中的蛋白表达水平也显著上调(P0.05)。
结论：胰腺癌细胞株经培美曲塞诱导后，其组蛋白HIST1H2AC 和HIST1H2BC在基因和蛋白表达水平上均出现上调，提示HIST1H2AC 和HIST1H2BC基因可能与耐药有关。
【关键词】 HIST1H2AC; HIST1H2BC; 胰腺癌; Puta8988; 培美曲塞;表达[Abstract] Objective: To investigate the expression of HIST1H2AC and HIST1H2BC genes in pancreatic cancer cell line Puta8988 treated with pemetrexed, and to verify the relationship between the genes and pemetrexed resistance. Methods: Pancreatic cancer cell line Puta8988 was treated with two doses of pemetrexed to get Puta8988+ and Puta8988++ with pemetrexed resistance, and the expression levels of HIST1H2AC and HIST1H2BC and their genes in Puta8988, Puta8988+ and Puta8988++ were detected by qRT PCR and Western blotting respectively. Results: Results detected by qRT PCR showed that expression levels of HIST1H2AC and HIST1H2BC genes were significantly up regulated in Puta8988+ and Puta8988++(P0.05). Results detected by Western blotting showed that expression levels of HIST1H2AC and HIST1H2BC were also significantly up regulated in those cell lines with pemetrexed resistance(P0.05). Conclusion: Expressions of HIST1H2AC and HIST1H2BC and their genes in pancreatic cancer cell line Puta8988 treated with pemetrexed are significantly up regulated, which implies that these genes possibly plays a role in pemetrexed resistance of pancreatic cancer cell lines.[Key words] HIST1H2AC; HIST1H2BC; pancreatic cancer; Puta8988; pemetrexed; expression胰腺癌起病隐匿，手术切除率低，对传统放化疗不敏感，死亡发病比达98%，5年生存率6%[1-2]，是威胁人类健康的“隐秘杀手”。
近年来的研究表明，辅助化疗有比传统化疗更好的疗效，已被认为是与手术治疗同样重要的治疗方法。
与此同时，多种针对胰腺癌的靶向药物也在不断被发现。
然而，耐药现象的存在仍然是导致辅助化疗效果欠佳或失败的主要原因。
揭示胰腺癌化疗的耐药机制，建立更有效的化疗方法已成为国内外研究的重点[3];而从分子生物学的层面来研究和寻找耐药基因，然后给予必要的干预，以提高辅助化疗疗效的研究已成为当前最为关注的热点[4]。
已有的研究表明，胰腺癌耐药性与MDR1(multidrug resistance1)、MRP(multidrug resistance associated protein gene)、LRP(lung resis 2 tance protein)、Bcl2(B cell lym phoma/leuke2)以及P53等基因有关，而这些基因的一个共同特点是与其他癌症的耐药性也有关[5]。
这就提示我们可以借鉴其他癌症发现的耐药基因研究胰腺癌的耐药机制。
有报道指出，组蛋白HIST1H2AC(Histone 1,H2ac)和HIST1H2BC(Histone 1,H2bc)基因与乳腺癌耐药性密切相关[6]。
然而，它们是否在胰腺癌耐药细胞株中表达至今很少有报道。
本实验针对胰腺癌耐药细胞株中HIST1H2AC和HIST1H2BC在基因和蛋白水平上的表达情况开展研究，以探讨它们与胰腺癌耐药的关系及其可能的分子机制，为研发对抗和逆转耐药的新方法提供新的靶点。
1 材料与方法1.1 材料人胰腺癌细胞株：采用由东南大学中心实验室保存的人胰腺癌细胞株Puta8988。
主要试剂：DMEM高糖培养基、胰蛋白酶为美国GIBCO 公司产品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，TRIZOL细胞裂解液为美国Invitrogen公司产品，培美曲塞(pemetrexed)为法国礼来公司产品，HIST1H2AC单克隆抗体和HIST1H2BC多克隆抗体为美国Abnova 公司产品，二抗(羊抗小鼠 IgG HRP)为南京凯基生物公司，PDVF膜为美国PALL公司产品，PCR引物由南京凯基生物公司合成。
主要仪器：北京泰克生物技术有限公司Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)，日本Nikon公司倒置相差显微镜，美国BECKMAN公司高速冷冻离心机，美国Bio Rad公司电泳仪等。
1.2 方法1.2.1 细胞培养胰腺癌细胞株Puta8988，以1/2 IC50浓度的培美曲塞作耐药诱导，形成耐药细胞株Puta8988+。
将培美曲塞浓度增加1倍再次作耐药诱导，形成耐药细胞株Puta8988++。
Puta8988+、Puta8988++培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃、5%CO2条件下培养，隔天换液，细胞长满单层后用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化传代。
1.2.2 实时荧光逆转录聚合酶链反应(qRT PCR) 细胞总RNA提取按照Trizol试剂盒说明进行。
逆转录合成cDNA的反应总体积为20 μl，RT的反应条件是：37 ℃温育30 min后，升温至65 ℃加热5 min，然后4 ℃冷却5 min，瞬时离心。
先在37 ℃保温1 h，然后70 ℃保温15 min。
反应产物行下一步扩增或-20 ℃保存。
根据Gene Bank中HIST1H2AC、HIST1H2BC的cDNA序列用Primer 5.0设计特异性扩增引物，见表1。
采用25 μl总反应体系：2×RTmix 12.5 μl;模板(cDNA稀释10倍) 1 μl;引物5 pmol·μl-1 mix 1 μl;双蒸水10.5 μl扩增条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s、表1 PCR所用的引物序列及扩增产物大小60 ℃ 30 s，45个循环。
一个样本做3个复孔，在96孔板中上样定量检测。
1.2.3 Western blotting 分别从培养好的细胞株提取细胞总蛋白进行定量，细胞总蛋白量为70 μg，将3组细胞的蛋白质常规PAGE 凝胶电泳并转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1 h后加入封闭液和一抗HIST1H2AC抗体(1∶500)，HIST1H2BC抗体(1∶500)。
在4 ℃下摇床摇荡孵育过夜。
PBST漂洗滤膜4次，每次10 min。
将膜与HRP结合的二抗(辣根过氧化酶标记抗体, 二抗用封闭液稀释1∶5 000)室温下摇荡孵育1 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。
暗室中迅速将膜蛋白贴在X线胶片上曝光，直至出现最佳条带。
1.3 统计学处理实验数据以±s表示，采用Prism软件包分析，组间比较用t检验，P0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 qRT PCR检测HIST1H2AC和HIST1H2BC基因在不同耐药处理胰腺癌细胞株中的表达水平以目标基因拷贝数与βactin拷贝数之比乘以100为HIST1H2AC和HIST1H2BC基因在不同耐药处理胰腺癌细胞株Puta8988中的相对表达水平，实时荧光PCR检测结果(图1)表明，1/2 IC50浓度培美曲塞诱导的耐药细胞株Puta8988+，其HIST1H2AC基因的相对表达水平调高，由其亲本Puta8988(对照)的0.340±0.070提高到1.577±0.276，上升幅度达 4.64倍。
如果培美曲塞的浓度加倍，Puta8988++中HIST1H2AC基因的相对表达水平进一步提高，达2.000±0.185，是对照的 5.88倍，各处理间的差异均达到显著水平(P0.05)。
HIST1H2BC基因在上述耐药细胞株及其亲本中的表达水平也有同样的趋势，但就其相对表达量而言，要比HIST1H2AC的低，在Puta8988、Puta8988+、Puta8988++中分別为0.027±0.003、0.153±0.023和0.623±0.048，在Puta8988+、Puta8988++中HIST1H2BC 的mRNA相对表达水平分别比对照(Puta8988)调高5.67倍和23.07倍，各处理间的差异也达到了显著水平(P0.05)。