实验十二微生物实验操作基础——灭菌及无菌操作
一、目的要求
学习灭菌的方式方法，区别几种灭菌方式的相同点和不同点。

掌握实验室无菌操作的操作方法和注意事项，体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。

二、知识介绍
灭菌技术sterilization
为什么要灭菌？（杂菌污染的后果）
1.营养基质或产物被消耗损失；
2.抑制生产菌的生长；
3.抑制产物的生物合成；
4.杂菌繁殖导致培养液性质（如pH）改变，造成生物反应异常。

灭菌原理与方法
灭菌(sterilization）是指利用物理或化学方法，杀灭或去除物料或设备中所有微生物的技术或工艺过程。

灭菌方法有化学物质灭菌、辐射灭菌、过滤介质除菌和热灭菌等。

（一）、化学物质灭菌
通过改变微生物细胞膜的渗透性，或者损伤细胞膜，影响微生物细胞的正常代谢。

不适合于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。

1.无机酸、碱及盐类
酸碱的杀菌能力主要由其电离度而定，电离出得氢离子或氢氧根离子浓度越高，杀菌力越强。

盐溶液的杀菌力与其浓度成正比。

（腌咸菜可以保藏很长时间而不染菌）
2.重金属盐
杀菌原理是重金属盐使细胞中蛋白质失活。

比如升汞。

服食牛奶、
鸡蛋等高蛋白含量食物可解毒。

3.氧化剂
高锰酸钾
4.有机化合物
乙醇：脱水、使蛋白质变性和沉淀，70~75%最有效。

(二)、辐射灭菌
1.紫外线：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；空气在紫外线照射下产生臭氧，臭氧也具有一定的杀菌作用。

2.X射线、γ射线：能量极高，被菌体吸收后，菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、过氧化氢和有机过氧化物，这些过氧化物阻碍微生物的代谢活动而导致菌体迅速死亡。

（三）、过滤介质除菌
工业上利用过滤的方法制备大量的无菌空气，供好氧微生物的深层培养使用。

（四）、干热灭菌
1.火焰灼烧法
2.干热空气灭菌法：140~160℃维持2~3h。

（五）、湿热灭菌
湿热灭菌条件为121℃维持20~30min。

巴氏杀菌（Pasteurization）低温消毒法，主要应用于生产酸奶乳制品。

目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种：
1.一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。

采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。

第二种方法将牛奶加热到75~90℃，保温15~16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。

但杀菌
的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。

无菌操作
(一）基本原理
高温对微生物具有致死效应，在微生物接种时，一般在酒精灯旁进行，用火焰直接灼烧接种环，
以达到灭菌的目的。

自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

平板分离法常用的有：稀释涂布平板法、稀释混合平板法与平板划线法。

不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养
特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。

(二）、讲授重点
1.倒平板：灭菌的培养基冷却到55℃左右，摇匀。

解开麻绳，去掉三角瓶口上盖，右手持装培养基的三角瓶在酒灯旁，瓶口对着火焰。

左手持9cm无菌培养皿并将皿盖在火焰旁打开一条缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，平置于桌面上，使培养基均匀分布于皿底，待冷凝后即为平板。

2.平板稀释法和涂布平板法
三、实验操作步骤
灭菌：高温蒸汽灭菌锅20 MIN，120 ℃
标记：用记号笔对待接试管斜面培养基进行标记，写上待接菌种名称、接种日期、组别。

稀释菌：酒精灯附近进行
混合菌液和熔化冷却至培养50-60 ℃（手触可接受温度）以下的培养基倒平板
培养：平板倒置培养基面在上放37℃培养箱中培养24-36小时。

四、实验过程中的注意事项
1.无菌接种技术
无菌操作需在火焰旁进行，手不可触摸试管口端，以防烫伤；接种时接种环不要碰触试管口边，
防止污染；塞盖不可放在桌面上，应该用右手手缘或右手指间夹住，或玻璃盖放后火焰灭菌盖上。

操作台及不可高温蒸汽灭菌物品使用前和使用后用75%酒精消毒。

2平板分离技术
倒平板时，培养皿边缘不要沾染培养基，摇匀培养基时要轻，以防培养液溅到皿盖或溢出培养皿；平板培养微生物时一定要倒置培养。

七、实验结果
1
．记录液体培养基和固体斜面培养基上，细菌的生长状况。

2
．记录菌种分离培养的结果。

八、实验操作考核点
1
．无菌操作
2
．平板划线方法是否正确。