实验研究¬非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP中microRNA表达的初步研究陆晓, 孙婧, 高雯, 徐小涛, 束永前南京医科大学第一附属医院肿瘤科,江苏南京210029Analysis of microRNAs in drug2resistant NSC LC cell line A549/DDPL U X iao,S U N J ing,GA O Wen,X U X iao2tao,S HU Yong2qianDepartment of Oncolog y,Fi rst A f f liated Hos pital of N anj ing Medical Universit y,N anj ing210029,P.R.China【摘要】 目的:应用miRNA芯片技术检测非小细胞肺癌(NSCL C)细胞株A549及顺铂(DDP)耐药株A549/DDP miRNAs表达的差异。
方法:M T T法检测A549/DDP相对于其亲本细胞A549的耐药性和耐药倍数;分别提取2种细胞的总RNA进行质检;microRNA 芯片检测NSCL C细胞株A549及对应的DDP耐药株A549/DDP中miRNA表达差异;采用real2time PCR验证结果。
结果:DDP 对A549和A549/DDP细胞的IC50值分别为7147和137.32μmol/L,两者差异有统计学意义(P<0.01),耐药倍数为18.38倍。
microR2 NA芯片结果显示,耐药株A549/DDP与亲本细胞系A549比较有34条有差异表达的miR2 NA(19条上调,15条下调)差异比值>115倍或<0167倍,P<0105;real2time PCR的结果进一步证实miR221、miR231和miR2374在A549/DDP中显著上调,而miR2378、miR28862 5p、miR288623p和miR2520c23p在A549/DDP 中显著下调。
结论:A549/DDP与A549的miRNA的表达谱存在差异,miRNA可能参与NSCLC DDP耐药,为进一步研究miRNA在NSCLC DDP耐药机制中的作用奠定基础。
中华肿瘤防治杂志,2010,17(9):659-663[ABSTRACT] OB JECTIVE:To analyze the difference in miR2 NAs expression between A549and A549/DDP cells and explore the association between miRNA and cisplatin resistanc of non2 small cell lung cancer(NSCL C).METH ODS:The drug resistance of A549/DDP cells was evaluated by using M T T assay.The total RNA of the two cell lines was isolated and examined.The miR2 NA expressions of A549/DDP and A549were analyzed by using microarray and the results were confirmed by real2time PCR.RE2 SU LTS:The values of IC50of cisplatin to A549cells and A549/ DDP cells were7.47and137.32μmol/L respectively(P< 0101).The drug resistance index of A549/DDP cells relative to the parental A549cells was18.38.The microarray analysis showed that34human miRNAs were differentially expressed be2 tween two cell lines(Fold change>1.5or<0.67,and P< 0105).Compared to A549cells,there were19miRNAs up2regu2 lated and15miRNAs down2regulated in A549/DDP,Among the differentially expressed miRNAs,miR221,miR231and miR2374 were upregulated and miR2378,miR288625P,miR288623P were downregulated,whose expression was f urther validated by red time PCR.CONC L USIONS:NSCL C resistant to cisplatin is asso2 ciated with a group of miRNAs.This finding provides an experi2 mental basis for f urther study of mechanism underlying the cispl2 atin resistance of NSCL C.Chin J Cancer Prev T reat,2010,17(9):659-663【关键词】 癌,非小细胞肺;顺铂;抗药性,肿瘤;芯片;microRNA[KE YWOR DS] carcinoma,non2small2cell lung;cisplatin;drug resistance,neoplasm;microarray;microRNA 【中图分类号】 R734.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-5269(2010)09-0659-05【基金项目】 江苏省医学重点学科项目(XK200718)【第一作者简介】 陆晓,女,江苏常熟人,硕士,主要从事肺癌化疗耐药的基础研究工作。
Tel:86-25-68136043 E2mail:luxiao1228@【通讯作者简介】 束永前,男,江苏苏州人,教授,博士生导师,主要从事肺癌的早期诊断、个体化治疗、靶向治疗及预后因素分析的基础及临床研究工作。
T el:86-25-83718836-6428 E2mail:shuyongqian@ micro RNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类小分子非编码RNA,在转录后水平调节基因表达[1]。
研究表明,miRNA的表达与多种癌症相关,在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的生物学作用,且可能与肿瘤的耐药性密切相关[224]。
顺铂(cisplatin, DDP)是非小细胞肺癌(non2small cell lung cancer, NSCL C)化疗的一线药物,但其获得性耐药制约了其疗效的发挥[5]。
本研究通过miRNA表达谱芯片技术,检测DDP耐药的NSCL C细胞株与敏感株中miRNA表达的差异,筛选出与NSCL C DDP耐药相关的miRNAs,初步探讨miRNA与NSCL C DDP耐药的关系。
1 材料与方法1.1 主要材料和试剂CO2培养箱(德国Kendro Heracell公司),Ta Ka2 Ra PCR Thermal Cycler(宝生物工程有限公司),ABI PRISM7900system(Applied Bio systems),酶标自动分析仪(澳大利亚AS YS公司Clinibio128c型),台式离心机(德国Eppendorf公司),NSCL C细胞株A549及DDP耐药细胞株A549/DDP购自上海麦莎生物科技有限公司,RPM I1640完全培养基和胎牛血清购自Hyclone公司,胰酶购自GIBCO公司,DDP购自南京制药厂,四甲基偶氮唑盐(M T T)和DMSO购自Sigma 公司,TRIZOL购自invitrogen公司,PCR引物由上海英骏公司合成,miRNA芯片购自Exiqon公司的L NA TM miRNA,miRCU R Y TM Array Power标记试剂盒为Exiqon公司,Real2time PCR试剂盒购自Invit rogen公司。
1.2 细胞培养人肺腺癌细胞株A549和A549/DDP用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI1640培养液为完全培养,在37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。
为保持A549/DDP的耐药性,该细胞需培养在含DDP0.5μg/mL的上述培养液中,于实验的前2d更换为无DDP的上述RP2 M I1640培养液。
细胞呈贴壁生长,2～3d传代1次,选择对数生长期的细胞实验。
1.3 MTT法测定A549/DDP对A549的耐药倍数取对数生长期细胞消化,制备单细胞悬液,以浓度4×104mL-1,接种96孔培养板中(100μL/孔)。
实验分为A549/DDP组和A549组,每组分实验组和对照组。
培养12h,分别加入终浓度为10、20、40、80、160和320μmol/L的DDP,终体积为200μL,每组浓度设4个复孔。
在37℃、5%CO2培养箱中培养48h,每孔加入5mg/mL M T T20μL,继续培养4h,去上清,每孔加DMSO原液150μL,培养板置于震荡器上震荡10min,用酶标仪测定各孔OD492值。
抑制率(%)=(1-实验组A值-空白对照组A值实验对照组A值-空白对照组A值)×100% 采用直线回归法计算DDP的半数抑制浓度IC50值。
实验重复3次。
耐药倍数=耐药株IC50值敏感株IC50值1.4 总RNA的提取及质量检测用Trizol分别提取A549和A549/DDP中的总RNA,细胞样品裂解后室温放置5min,以便核酸蛋白复合体完全解离。
每1mL的Trizol试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿,涡旋15s,室温放置3min, 4℃12000r/min离心15min(r=5.5cm)。
离心后收集上清,加入0.5mL的异丙醇,混匀后室温放置10min,再于4℃12000r/min,离心10min(r= 5.5cm)。
移去上清液,加入1mL含有D EPC水的75%乙醇,清洗RNA沉淀。
振荡后,4℃5000r/min 离心5min(r=5.5cm)。
倒尽液体,空气中干燥RNA 沉淀5～10min,沉淀溶于50μL D EPC水。