小鼠部分组织的石蜡切片制作
一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包
埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。
用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其
组织结构。
二、材料与用具
1 •材料：小鼠肝脏、脾脏等。
2 •用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。
三、实验内容与步骤
1 .取材及固定
取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组
织块。
用先用0.85%的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污
物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀
或其他器具刮之。
由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。
如果是
管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。
取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1 ,
固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70%酒精中保存。
不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。
2 .冲洗
固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。
3 .脱水和硬化
经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换
出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。
常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。
脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。
脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。
脱水所用的酒精浓度及过程如下：
30%> 5C%> 7%> 80%> 9%> 95%> 10（% （I ）> 10（% （n ）
组织块在各级较低浓酒精（小于70% ）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过
0.5立方厘米的组织块脱水时间为6〜12 hr，在高浓度酒精中（大于70%）脱水时间为3 hr
左右。
组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。
由于无水酒精有使组织变脆
的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15〜30 min左右。
在脱水瓶中酒
精的量与组织块之比约为50:1。
简化步骤如下：
70% （一夜）——80% （1 hr）——90% （30 分）——95% （30 分）——100% （15 分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分）
4 .透明
透明是石蜡切片法切片前必经的一步。
其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒
精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。
经
过透明剂处理的组织块用肉眼对光观察呈透明现象，所以这个过程称为透明。
常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等，这些都是穿透力强易使组织变脆的透明剂， 因此透明
的时间宜短，一般在 20 min 即可。
透明时组织块由无水酒精中取出，先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶剂中 然后取出放入纯二甲苯中
20 min 即可。
5 .浸渗
浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中， 然后再通过各种方法使这种物质
凝固，而将组织材料包埋其中。
石蜡切片法和火棉胶切片法都需要浸渗过程。
石蜡切片法是将加热的石蜡渗到组织中而火棉 胶切片法
是使火棉胶渗到组织间隙中去。
在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中，
使其杂质沉淀。
石蜡最好选用软 蜡和硬蜡两种，软蜡熔点为 45〜50C 之间，硬蜡熔点为 56〜58C 之间，60〜62C 的硬蜡很 少用。
冬天室温较低时多用软蜡，夏天室温较高时多用硬蜡。
浸渗应在自动恒温箱中进行。
组织块在各个蜡杯中浸蜡的时间如下： 软蜡1 30mi n 软蜡2 30min 硬蜡1 30〜60min 硬蜡2
60〜120min
这一时间不是固定不变的，应视组织块的种类及大小而相应延长或缩短浸蜡时间。
浸蜡的总
时间一般为：0.5立方厘米的组织块时间为 6〜8 hr ; 0.2〜0.3立方厘米的组织块时间为
3〜5
hr ； 0.1〜0.2立方厘米的组织块时间为 2〜3 hr 。
当发现蜡杯中有灰尘或组织碎块时应使其沉
淀或过滤后再使用。
浸蜡不透包埋后会出现白色不透明部分，此时需要在浸蜡一次。
6 .包埋
包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中，石蜡包埋法如下。
浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡槽内， 然后从第四 个蜡杯中取出组织块，放入蜡槽内， 摆好位置，注意组织切面的摆放方向。
自然冷却，也可以放入冷水中直接冷却。
7 .修块和切片
取已经包埋好的蜡块， 将纸盒拆下，用加热的刀片或解剖刀将其分成若干块 （每块组织占 块）,用解剖刀将组织块周围多余的石蜡切去，注意不要切到组织。
把有组织的蜡块修成正 方形或梯形。
在进行塑型时一定要注意组织块切面的方向。
蜡块塑好后将其粘在小木块上。
注意要粘牢。
最后在木块侧面用铅笔记上组织块名称、编号。
切片时采用手摇连续切片机。
使用切片机进行切片时，将蜡块固定在切片机上，调好距离和 所要求的切片厚度，然后用右手摇动手柄，即可进行切片了。
一般来讲生物切片的厚度在 5〜 10微米。
对于切下的切片不要用手去取，
因为体温可以使蜡片粘到手上，
正确的做法是用毛笔或牙签
挑取，然后放在载玻片上进行展片和粘片。
&展片和粘片
切下的组织蜡片往往带有皱褶，所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘片， 即把切好的蜡片
平整的粘在载玻片上。
展片的温度因石蜡熔点的不同而的不同，一般的
56〜58C 的石蜡切
片C 的温水进行展片，48〜52 C 的石蜡切片用35 C 的温水进行展片。
等到蜡片充分展平后， 取一清洁载玻片，载玻片上涂一薄层蛋白甘油，然后在水中捞取蜡片，捞完后将蜡片摆正， 放到格盘内，置 38C 温箱中烘干，然后即可进行染色。
展片和粘片比较简单容易做， 但是如果处理不好则无法进行染色，
即使能染上色，组织切片
内部的结构也往往被破坏。
1 hr 左右,
放好组织后可以
9 .染色和封固采用苏木精伊红对染法（HE）染色结果是细胞核为紫色，细胞质为粉红色；苏木精伊红染色法整个染色过程如下：
取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡10min左右，这个过程称为脱蜡。
脱完
蜡后的切片即可进行染色，具体染色过程和时间如下：
(1)100 %酒精洗去二甲苯2〜5min。
(2)95%酒精2 〜5min。
(3)90%酒精2 〜5min。
(4)80%酒精2 〜5min。
(5)70%酒精2 〜5min。
(6)50%酒精2 〜5min。
(7)蒸馏水洗2〜5min。
(8)苏木精染液10〜20min。
(9 )普通水洗1min。
(10)盐酸酒精分色数秒〜半min (70 %酒精100 mL+盐酸1 mL),分色到切片为带粉红色后立即取出。
(11)自来水冲洗数h r。
镜检切片呈清朗的蓝色，细胞核非常明显。
(12 )蒸馏水洗1min。
(13)50%酒精2 〜5min。
(14)70%酒精2 〜5min。
(15)80%酒精2 〜5min。
(16 )伊红酒精溶液对比染色2〜5min (95%酒精+ 0.5g伊红)。
(17) 95%酒精2 〜5min。
(18 )无水酒精I 3min。
(19 )无水酒精n 3min。
(20)无水酒精加等量二甲苯2min。
(21 )二甲苯数min到透明为止。
(22)自二甲苯中取出切片，放在格板内，滴少量的树胶于组织片中央。
(23)取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近载玻片，然后迅速放下盖玻片，树胶即迅速扩张到四周，校正好盖玻片方向。
将封好的切片放置在恒温箱中干燥。
最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染
色方法、固定方法、年月日。
四、显微摄影
封片完全凝固后，放在显微镜下观察，选择较好的切片在尼康显微镜下进行拍摄，图像保存为jpg格式文件。
五、实验结果
在观察到的小鼠肝组织中，细胞核被染为蓝色，细胞质被染为红色。